Strukturbestimmung der membranständigen Protease LspA mittels NMR Spektroskopie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
LspA ist ein bakerielles Protein, das für die Prozessierung von Signalpeptiden bakterieller Proteine zuständig ist. Damit übernimmt dieses Protein essentielle Aufgaben in der bakteriellen Zelle, was es zu einem sehr guten potentiellen Target für die antibakterielle Wirkstoffentwicklung macht. LspA ist ein Membranprotein. Strukturbestimmung von Membranproteinen stellt noch immer eine große Herausforderung dar. Wir haben in den letzten Jahren ein zellfreies Expressionssystem etabliert, das auf die Expression größerer Mengen von Membranproteinen für strukturelle Untersuchungen optimiert ist. Da in der zellfreien Synthese der zelluläre Metabolismus weitestgehend unterdrückt ist, ist diese Methode bestens geeignet, um seletiv markierte Proteine herzustellen, in denen nur bestimmte Aminosäuren oder sogar nur bestimmte chemische Gruppen in diesen Aminosäuren markiert sind. Zudem eignet sich die zellfreie Expression dafür, Membranproteine direkt in eine geeignete hydrophobe Umgebung hinein zu exprimieren. Nanodiscs haben sich in der Zwischenzeit als der Goldstandard für die Untersuchung von Membranproteinen herausgestellt, da in ihnen die Proteine in einer Lipid-Doppelmembran eingebettet sind. Allerdings sind die NMR Spektren von Membranproteinen in Nanodiscs oft von geringer Qualität, was mit der Gesamtgröße der Partikel zusammenhängt. Durch Zufall haben wir in diesem Projekt eine Methode gefunden, wie die Qualität von NMR Spektren von Membranproteinen erheblich gesteigert werden kann. Durch Titration mit Detergenzien lassen sich sowohl das MspA Protein als auch überflüssige Lipide entfernen und ein Partikel bilden, das aus dem Membranprotein sowie essentiellen Lipiden besteht. Diese Partikel stellen wahrscheinlich Bicellen dar. Die geringere Größe dieser Partikel erlaubt es, mehrdimensionale Spektren von Proteinen aufzunehmen. Dadurch konnten wir durch die Kombination uniform markierter Proben mit verschiedenen selektiv markierten Proben die Rückgratresonanzen von LspA in Bicellen ermitteln und dadurch die Sekundärstruktur bestimmen. Zudem haben wir auf der Basis der LILBID Massenspektrometrie gezeigt, dass mit dieser sanft ionisierenden Methode sich native Komplexe von Membranproteinen untersuchen und der oligomere Zustand sich bestimmen lassen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2015) Labeling of membrane proteins by cellfree expression. Methods Enzymol. 565:367-88
LaGuerre A, Löhr F, Bernhard F, Dötsch V
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/bs.mie.2015.06.001) - (2016) From Nanodiscs to Isotropic Bicelles: A Procedure for Solution Nuclear Magnetic Resonance Studies of Detergent-Sensitive Integral Membrane Proteins. Structure 24:1830-1841
Laguerre A, Löhr F, Henrich E, Hoffmann B, Abdul-Manan N, Connolly PJ, Perozo E, Moore JM, Bernhard F, Dötsch V
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.str.2016.07.017) - (2017) Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. Elife 9;6. pii: e20954
Henrich E, Peetz O, Hein C, Laguerre A, Hoffmann B, Hoffmann J, Dötsch V, Bernhard F, Morgner N
(Siehe online unter https://doi.org/10.7554/eLife.20954) - (2017) Insights into Cotranslational Membrane Protein Insertion by Combined LILBID-Mass Spectrometry and NMR Spectroscopy. Anal Chem. 89:12314-12318
Peetz O, Henrich E, Laguerre A, Löhr F, Hein C, Dötsch V, Bernhard F, Morgner N
(Siehe online unter https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b03309) - (2018) Protein labeling strategies for liquid-state NMR spectroscopy using cell-free synthesis. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 105:1-22
Hoffmann B, Löhr F, Laguerre A, Bernhard F, Dötsch V
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.pnmrs.2017.11.004)
