Untersuchung der Substratspezifizität und Aktivitätsregulierung der Rhomboid Proteasen

• Antragsteller: Professor Dr. Steven Verhelst
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 262132838

Intramembranproteasen sind außergewöhnliche Enzyme, die ihre Substrate innerhalb der hydrophoben Umgebung der Membran spalten. Im Allgemeinen sind die Substrate inaktiv an die Membran gebunden und rufen nach Abspaltung biologische Effekte hervor. Rhomboide bilden die Familie der Intramembranserinproteasen. Strukturell sind Rhomboide die am besten charakterisierte Gruppe von Intramembranproteasen und deswegen stellen sie ein Paradigma für die Intramembranproteolyse dar. Interessanterweise sind Rhomboid-kodierende Gene in fast allen sequenzierten Organismen gefunden worden, allerdings ist deren funktionelle Rolle in den meisten Fällen unbekannt. In Fällen in denen die biologische Funktion bekannt ist, zeigt sich, dass Rhomboide ein großes Spektrum an Aufgaben haben; von der zellulären Kommunikation bis hin zum Eindringen bestimmter Parasiten in die Wirtszelle. Allerdings bleiben in der Rhomboidforschung einige Schlüsselfragen offen: Wie funktioniert die selektive Substraterkennung bei Rhomboiden? Wie erlangt das Substrat Zugang zum aktiven Zentrum? Können selektive Inhibitoren entworfen werden? Wie wird die Rhomboidaktivität reguliert? Die spezifischen Ziele des in diesem Antrag beschriebenen Projektes befassen sich mit einigen dieser Fragen. In bisherigen Studien zur Rhomboidsubstratspezifität mit spezifischen Proteinsubstraten wurden widersprüchliche Resultate gewonnen. Wir werden die Rhomboidsubstratspezifizität mittels einer unvoreingenommenen, auf Proteomik basierenden Methode aufklären. Mit vom Proteom abgeleiteten Peptidbibliotheken werden wir die von verschiedenen Rhomboiden spaltbaren Peptidbindungen massenspektrometrisch identifizieren. Die daraus resultierenden Erkenntnisse werden dann für die Entwicklung neuer fluorogener Substrate und neuer peptidartiger Inhibitoren eingesetzt. Anschließend wird ihre Selektivität sowie der Ort ihrer Wechselwirkung mit den Rhomboiden bestimmt. Obwohl die meisten Proteasen als inaktive Zymogene produziert werden, werden Rhomboide in ihren aktiven Formen dargestellt. Es gibt Hinweise, daß die hydrophobe Umgebung der Membran die Spaltung des Substrats beeinflußt. Um einen tieferen Einblick in diesen Prozess zu erhalten, werden wir Rhomboide verschiedener prokaryotischer und eukaryotischer Spezies exprimieren und aufreinigen, und sie in Liposomen mit verschiedener Zusammensetzung der Lipide rekonstituieren. Mit unseren vor kurzem entwickellten Rhomboid aktivitäts-basierten Sonden haben wir die geeignete Methode um die Aktivität von Rhomboiden zu messen. Insgesamt wird dieses Forschungsprojekt wertvolle Informationen über die Aktivitätsregulierung und Substratspezifizität der Rhomboide geben.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen