Nanoflare-based isolation of cardiac progenitor cells derived from murine and human pluripotent stem cells

• Applicant: Professor Dr. Markus Krane
• Subject Area: Cardiac and Vascular Surgery ; Evolutionary Cell and Developmental Biology (Zoology) ; Cardiology, Angiology
• Term: from 2014 to 2019
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 262640928

• Final Report Year: 2018

Final Report Abstract

Die Verwendung der Nanoflares zum Nachweis der Genexpression in lebenden Zellen war zum Zeitpunkt der Antragsstellung eine völlige neue Technologie, die durch entsprechende Kontrollversuche validiert werden musste. Für den Nachweis der Expression konstitutiv exprimierter Gene (Housekeeping-Gene, Pluripotenzfaktoren) konnten wir diese Validierung anhand entsprechender Negativkontrollen (Scramble Nanoflares) erfolgreich durchführen und mit Hilfe funktioneller Folgeexperimente bestätigen. Auch die Pilotversuche zur Markierung dreidimensionaler Zellkonstrukte verliefen erfolgreich. Bei der Detektion von ISLET1, NKX2.5 und TBX5 handelt es sich jedoch um Gene (Transkriptionsfaktoren), die nur in sehr geringem Masse exprimiert werden. In einer kürzlich veröffentlichten Publikation wurde die Expression von fünf Transkripten (HMOX1, IL6, PTGS2, NRG1, ERBB4) mit Hilfe von Nanoflares in verschiedenen Zellen untersucht. Dabei ergaben sich ähnliche Ergebnisse wie in unseren Experimenten. Es war den Autoren nicht möglich, mit Hilfe der Nanoflares verlässlich die Genexpression eines dieser Faktoren nachzuweisen. Es traten ähnliche Probleme wie in unseren Versuchen auf: Auch hier induzierten die Scramble-Nanoflares eine sehr hohe Backgroundfluoreszenz, die sich in der Intensität kaum von der Fluoreszenz unterschied, wenn Genspezifische Nanoflares zugegeben wurden. Offensichtlich scheint es bei der Background-Fluoreszenz, aus nicht geklärten Gründen, Schwierigkeiten zu geben, die nicht nur bei unseren Experimenten sondern auch in anderen Arbeitsgruppen auftreten. Sollte sich durch zukünftige, intensive Forschungsarbeiten dieser limitierende Faktor beseitigen lassen, stellt die Nanoflare Technologie immer noch eine sehr vielversprechende Technik zur Markierung, Identifizierung und Isolierung „lebender“ Zellen dar.

Publications

• Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles. J Vis Exp. 2015 Nov 13;(105)
  Lahm H, Doppler SA, Dreßen M, Adamczyk K, Deutsch MA, Ulrich H, Schiemann M, Lange R, Krane M
  
• Direct Reprogramming-The Future of Cardiac Regeneration? Int J Mol Sci. 2015 Jul 29;16(8):17368-93
  Doppler SA, Deutsch MA, Lange R, Krane M
  
• Tetralogy of Fallot and Hypoplastic Left Heart Syndrome - Complex Clinical Phenotypes Meet Complex Genetic Networks. Curr Genomics. 2015 Jun;16(3):141-58
  Lahm H, Schön P, Doppler S, Dreßen M, Cleuziou J, Deutsch MA, Ewert P, Lange R, Krane M
  
• A novel de novo TBX5 mutation in a patient with Holt-Oram syndrome leading to a dramatically reduced biological function. Mol Genet Genomic Med. 2016 Jul 14;4(5):557-67
  Dreßen M, Lahm H, Lahm A, Wolf K, Doppler S, Deutsch MA, Cleuziou J, Pabst von Ohain J, Schön P, Ewert P, Malcic I, Lange R, Krane M
  
• Cardiac fibroblasts: more than mechanical support. J Thorac Dis. 2017 Mar;9(Suppl 1):S36-S51
  Doppler SA, Carvalho C, Lahm H, Deutsch MA, Dreßen M, Puluca N, Lange R, Krane M
  
• MicroRNAs: pleiotropic players in congenital heart disease and regeneration. J Thorac Dis. 2017 Mar;9(Suppl 1):S64-S81
  Hoelscher SC, Doppler SA, Dreßen M, Lahm H, Lange R, Krane M
  
• Region and cell-type resolved quantitative proteomic map of the human heart. Nat Commun. 2017 Nov 13;8(1):1469
  Doll S, Dreßen M, Geyer PE, Itzhak DN, Braun C, Doppler SA, Meier F, Deutsch MA, Lahm H, Lange R, Krane M, Mann M
  
• Genome Editing Redefines Precision Medicine in the Cardiovascular Field. Stem Cells Int. 2018 Mar 14;2018:4136473
  Dzilic E, Lahm H, Dreßen M, Deutsch MA, Lange R, Wu SM, Krane M, Doppler SA
  
• Reactivation of the Nkx2.5 cardiac enhancer after myocardial infarction does not presage myogenesis. Cardiovasc Res. 2018 Jul 1;114(8):1098-1114
  Deutsch MA, Doppler SA, Li X, Lahm H, Santamaria G, Cuda G, Eichhorn S, Ratschiller T, Dzilic E, Dreßen M, Eckart A, Stark K, Massberg S, Bartels A, Rischpler C, Gilsbach R, Hein L, Fleischmann BK, Wu SM, Lange R, Krane M