Charakterisierung Sialinsäure-spezifischer O-Acetyltransferasen: vom neuroinvasiven Bakterium zum menschlichen Wirt
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Rahmen dieses Kooperationsprojekts wurden neue Einblicke in den molekularen Mechanismus der Kapsel O-Acetylierung neuroinvasiver Bakterien und der O-Acetylierung von Sialoglykanen im menschlichen Wirt gewonnen. Bei der Bekämpfung invasiver Meningokokken-Erkrankungen bilden Schutzimpfungen die effektivste Maßnahme. Lizensierte Glykokonjugat-Vakzine basieren auf dem Meningokokken Kapselpolysaccharid (CPS) und sind für Neisseria meningitidis der Serogruppen A, C, W und Y verfügbar, die alle die Fähigkeit zur Kapsel O-Acetylierung aufweisen. Im Vergleich zu anderen Meningokokken Kapselpolysacchariden weist das CPS der Serogruppe A (NmA-CPS) die geringste Stabilität auf, was eine reduzierte Haltbarkeit der anti-NmA-Vakzine bedingt. Hier konnten wir zeigen, dass O- Acetylierung die labile Phosphodiesterbindung des NmA-CPS vor Hydrolyse schützt, die ausschließlich zwischen nicht O-acetylierten Zuckereinheiten auftritt. Unter Verwendung von drei biosynthetischen Enzymen gelang uns die zellfreie, enzymatische Totalsynthese von bioidentischem NmA-CPS und wir konnten Protokolle zur Steuerung des O-Acetylierungsgrades erarbeiten, um maximale Polymerstabilität zu erzielen. Durch Lösung der Kristallstruktur der NmA Kapsel-O-Acetyltransferase CsaC konnte die strukturelle Basis der strikten Regioselektivität des Enzyms für Position O3 der Monosaccharid-Einheiten aufgezeigt und Einblicke in den Reaktionsmechanismus gewonnen werden. Die Aufdeckung einer klassischen Ser-His-Asp Triade, die in CsaC überraschend durch einen Glutaminrest erweitert ist, zeigte einen neuen Weg auf, wie sich Transferaseaktivität aufbauend auf der katalytischen Maschinerie der α/β-Hydrolase Esterasen ausgebildet hat. Beim Menschen tritt O-Acetylierung als post-synthetische Modifikation von Sialinsäuren auf, einem negativ geladenen Zucker mit dem der Großteil der Oberflächen-Glykane abschließt. O-Acetylierte Sialinsäuren finden sich besonders häufig in den die Grenzflächen zur mikrobiellen Besiedelung auskleidenden Mucinen und spielen möglicherweise eine wichtige Rolle für kommensale Besiedelung und Wirt-Pathogen Interaktion. Mit Hilfe zellulärer Ansätze, einschließlich CRISPR/Cas basierter Genomeditierung, konnten wir das Golgi-lokalisierte Membranprotein CASD1 als Schlüsselenzym der Biosynthese O-acetylierter Sialoglykane identifizieren. Durch in vitro Studien erhielten wir Einblick in den Enzymmechanismus, der auf einer katalytischen Ser-His-Asp Triade basiert und über ein kovalentes Acetyl-Enzym Intermediat verläuft. Für die in das Lumen des Golgi-Apparates zeigende, katalytische Domäne von CASD1 konnten wir zeigen, dass diese Acetylgruppen von Acetyl-Coenzym A auf CMP-aktivierte Sialinsäure überträgt. In einem zweiten CRISPR/Cas Ansatz gelang es uns zu zeigen, dass der Acetyl-Coenzym A Transporter SLC33A1 für die Ausbildung O-acetylierter Sialoglykane eine entscheidende Rolle spielt. Für Mutationen im SLC33A1 Gen, die bei Patienten mit Huppke-Brendel Syndrom gefunden wurden, konnten wir zeigen, dass diese einen fast vollständigen Verlust der Sialinsäure O-Acetylierung nach sich ziehen, wodurch wir zum Verständnis der molekularen Ursachen dieser letalen, autosomal rezessiven Erberkrankung beitragen konnten.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2015) 9-O-Acetylation of sialic acids is catalysed by CASD1 via a covalent acetylenzyme intermediate. Nature Communications 6:7673
Baumann A-M, Bakkers MJ, Buettner FF, Hartmann M , Grove M , Langereis MA, de Groot RJ, Mühlenhoff M
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/ncomms8673) - (2018) Pre-B acute lymphoblastic leukemia expresses cell surface nucleolin as a 9-O-acetylated sialoglycoprotein. Scientific Reports 8:17174
Joo EJ, Wasik BR, Parrish C, Paz H, Mϋhlenhoff M, Abdel-Azim H, Groffen J, Heisterkamp N
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/s41598-018-33873-2)
