Mechanismus der Aquaporin-vermittelten Resistenz von Trypanosomen

• Antragsteller: Professor Dr. Eric Beitz
• Fachliche Zuordnung: Pharmazie ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 263523902

Die Therapie der Afrikanischen Schlafkrankheit ist suboptimal, da die Wirkstoffauswahl beschränkt und alt (1940) ist mit z.T. tödlichen Nebenwirkungen. Unsere Projektvorarbeiten weisen darauf hin, dass die Entdeckung David Horns, Dundee, UK, einer Aquaporin-vermittelten Resistenz (TbAQP2) gegen Pentamidin/Melarsoprol in ein neues Prinzip zum Einbringen von Wirkstoffen in die Parasiten verwandelt werden kann.David Horn postuliert, dass Pentamidin und Melarsoprol direkt durch TbAQP2 diffundieren könnten. Aufgrund unserer Erfahrung mit AQPen bezweifeln wir, dass so große und geladene Moleküle TbAQP2 passieren. Unsere Funktionsassays zeigten vollständige Hemmung von TbAQP2 durch Pentamidin und eine außerordentliche Affinität (IC50 = 130 nM). Wir titrierten den pKs der Pentamidin-Bindestelle und synthetisierten Pentamidin-Derivate, um einen Bindemodus zu erstellen. Unsere Vorarbeiten deuten auf Rezeptor-vermittelte Endozytose mit TbAQP2 als Rezeptor anstelle einer Aufnahme durch Diffusion hin.Wir werden im Antrag drei Zielen nachgehen:1. Wir werden die Frage der Bindung vs. Permeation von Pentamidin untersuchen. Dazu messen wir die generelle Kationenpermeabilität von TbAQP2 mit etablierten Tests für Ammonium und Methylammonium. Falls diese kleinen Kationen ausgeschlossen werden, dürfte auch das größere Pentamidin TbAQP2 nicht passieren. Wir ersetzen durch Punktmutationen ein auffälliges Aspartat im TbAQP2-Kanal (D265N, D265A), um den postulierten Bindemodus zu prüfen. Wir testen, ob Pentamidin auch das TbAQP2-verwandte TbAQP3 hemmt. Wir erwarten, dass dies nicht der Fall ist aufgrund von Sequenzunterschieden in der putativen Binderegion um das Aspartat. Zur Bestätigung des Bindemodus versuchen wir schließlich, durch Mutation ein Pentamidin-insensitives AQP in ein Pentamidin-hemmbares AQP zu überführen.2. Wir werden die Bindung/Permeation der zweiten von TbAQP2 abhängigen Substanz, Melarsoprol, untersuchen. Dazu messen wir die TbAQP2-abhängige Aufnahme von Melarsoprol in Hefe mit der Atomabsorptionsspektroskopie unter Ausnutzung des Arsenatoms in Melarsoprol, sowie die Hemmung des TbAQP2 durch Melarsoprol mit Hilfe von Lichtstreuungsassays.3. Wir werden die Bindung von Pentamidin an TbAQP2 sowie die Aufnahme in lebendige Trypanosomen visualisieren. Dazu synthetisieren wir fluroeszierende Pentamidin-Derivate und bestimmen deren Affinität zu TbAQP2. Genügend affine Verbindungen setzen wir in Kooperation mit David Horn zum Markieren kultivierter Trypanosomen ein. So visualisieren wir die Bindestelle, die zusammen mit TbAQP2 in der Flagellentasche liegen sollte. Außerdem analysieren wir die Temperatur-abhängige Endozytose der Verbindung in Trypanosomen mit hochauflösender Mikroskopie und geeigneten Gegenfärbungen. Die Aufnahme eines Fluoreszenzlabels würde den proof-of-concept eines neuen TbAQP2/Pentamidin-vermittelten Prinzips zur Einbringung von (Wirkstoff-)Molekülen in Trypanosomen darstellen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Großbritannien
• Beteiligte Person: Professor Dr. David Horn