FGFR3 als Marker für humane spermatogoniale Stammzellen, Grundlagenforschung für die humane Anwendung

• Antragstellerin: Dr. Kathrein von Kopylow
• Fachliche Zuordnung: Reproduktionsmedizin, Urologie
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 264290960

Bisher ist es nicht gelungen, die Identität der humanen spermatogonialen (spg) Stammzellen (hSSCs) hinreichend aufzuklären. Diese Zellen könnten jedoch therapeutisch eingesetzt werden.Wir haben mittels Microarray-Analyse (MA) den Fibroblastenwachstumsfaktor-Rezeptor 3 (FGFR3) als Spermatogonien (SPG)-spezifischen Marker identifiziert. Er kommt auf der Zelloberfläche und im Cytoplasma von nicht-proliferierenden und nicht-differenzierenden A-SPG vor, die zusätzlich den Pluripotenzmarker UTF1 exprimieren. Außerdem findet man das FGFR3-Protein lediglich in kleinen spg Zellclustern. Diese Befunde legen den möglichen Stammzellcharakter der FGFR3+ SPG nahe.Die Isolierung der FGFR3+ potentiellen hSSCs haben wir m.H. magnetischer Zellisolierung und anschließender Separation der Bead-gebundenen Zellen mit einem Mikromanipulator etabliert und optimiert. Mit dieser Methode ist die ausschließliche Isolierung der FGFR3+ SPG (100% angereichert) ohne somatische Kontaminationen aus kleinen Hodenbiopsien möglich. Die weitere Untersuchung der isolierten potentiellen hSSCs mittels Immunhistochemie ergab eine nukleäre Markierung mit dem Pluripotenzmarker UTF1, die Einzelzell-real time RT-PCR veranschaulicht die FGFR3-Expression der Bead-gebundenen SPG auf mRNA-Ebene, im Gegensatz zu den SPG ohne Beads. Dies zeigt, dass die die Beadbindung spezifisch ist und mit der Methode die richtige Zielzellpopulation isoliert wird. Ergebnisse der Lebend-Tot-Färbung demonstrieren, dass die Zellen vital sind. In der Zellkultur konnten die isolierten SPG bis zu 70 Tage mit unveränderter Morphologie erhalten werden. Außerdem war die Expression des Pluripotenzmarkers UTF1 über lange Zeit sichtbar, was bedeutet, dass die Zellen über die kultivierte Zeitspanne nicht in die Differenzierung eingetreten sind. Mit einer anhand von MA-Daten durchgeführten Pearson-Korrelationsanalyse konnten wir den Fibroblastenfaktor FGF9 als potentiellen Liganden von FGFR3 in humanen SPG identifizieren. Diesen haben wir bereits erfolgreich in der Zellkultur eingesetzt (s.o.). Er könnte eine self renewal-Teilung von humanen SPG fördern.Im beantragten Projekt sollen die isolierten FGFR3+ SPG per self renewal in einer optimierten Zellkultur unter Anwendung verschiedener etablierter Protokolle zur Expansion von hSSCs vermehrt werden. Weiterhin wollen wir eigene Wachstumsfaktorkombinationen in unterschiedlichen Konzentrationen testen. Hiermit sollen genügend Zellen für spätere Xenotransplantationen generiert werden, mit welcher der Stammzellcharakter der FGFR3+ SPG bewiesen werden kann. Vor und nach der Zellkultur sollen die Zellen hinsichtlich ihrer Markerexpression auf verschiedenen Genexpressionsebenen sowie ihrer epigenetischen Merkmale analysiert werden, um potentielle Veränderungen zu detektieren und auszuschließen.Die gewonnenen Erkenntnisse könnten zu einem therapeutischen Einsatz von hSSCs in der Medizin führen und neue Grundlagen zum Verständnis der humanen Spermatogenese schaffen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Kooperationspartner: Professor Dr. Ulrich Zechner, Ph.D.