Kti12 - Regulator der tRNA Modifikationsfunktion des Elongator-Komplexes aus Hefe?

• Antragsteller: Professor Dr. Raffael Schaffrath
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Biochemie ; Biologische und Biomimetische Chemie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 264621823

Der unter Eukaryonten konservierte Elongatorkomplex (Elp1-Elp6) fungiert bei der Modifikation von transfer-RNAs (tRNAs), stellt so die akkurate Dekodierung der Boten-RNA (mRNA) durch tRNAs sicher und ist daher wichtig für die Realisierung genetischer Information während der mRNA-Translation und Proteinbiosynthese. Um effiziente Dekodierung durch tRNAs zu jeder Zeit zu ermöglichen, sollte man annehmen, der Elongator sei permanent aktiv. Hinweise, dass in Antwort auf exogene und endogene Stimuli die tRNA-Modifikationen jedoch stakk schwanken können, lassen allerdings vermuten, dass der Elongator regulierbar ist. Entsprechend konnten wir zeigen, dass seine Aktivität dynamischer Phosphorylierungen unterliegt, die von einer Kinase (Hrr25) und einer Phosphatase (Sit4) abhängen und zudem durch das Protein Kti12 modulierbar sind. Kti12 selbst interagiert mit dem Elongator (und der Hrr25 Kinase), hat Ähnlichkeit mit einer tRNA-abhängigen Kinase (PSTK) und besitzt ein potenzielles Bindemotif für Nukleotide (NTP). Wie genau Kti12 die Elongatoraktivität beeinflusst und ob es dessen tRNA-Modifikationsfunktion reguliert, sind ungeklärte Fragen, die unter Verfolgung dieser, miteinander logisch vernetzter Ziele beantwortet werden sollen: - die Analyse post-translationaler Modifikation(en) von Kti12 mittels Massenspektrometrie, um potenzielle Modifizierungen zu identifzieren und mittels ortsspezifischer Mutagenese auf Funktionalität zu untersuchen und zu validieren- die Identifikation funktionsrelevanter Domänen auf Kti12 mittels genetischer Ansätze, die die Sequenzierung von Mutationen eines bereits etablierten kti12 Mutantenpools und ortsspezifische Mutaganese am KTI12 Gen beinhalten- die Analyse dieser Domänen unter Ausnutzung bekannter Schlüsseleigenschaften von Kti12, i.e. Elongatorinteraktion, Elongatorrekrutierung der Hrr25 Kinase, Elp1 Phosphomodulation etc., um deren potenzielle Rollen bei Elongatorfunktion und Regulation biochemisch zu charakterisieren - die Etablierung von in vitro assays mit rekombinantem Kti12 (und den oben identifizierten Mutanten im Vergleich), um vermeintliche Bindung von tRNA und Kofaktoren (NTPs) an Kti12 zu analysierenDiese komplementären Ansätze zielen darauf ab, Struktur-Funktionsbeziehungen zu erfassen, die für die Kti12-Elongator Interaktion und die mögliche Regulation der tRNA-Modifikationsfunktion durch Kti12 nötig sind. Basierend auf neuen Befunden, dass Elongator-abhängige tRNA-Modifikationen genetisch mit neurodegenerativen Syndromen und sogar Tumorbildung in menschlichen Zellen assoziert sein können, kommt unserem Projektvorschlag neben grundlagenorientierten Aspekten auch biomedizinsche Relevanz zu. Daher ist das Studium differenziell regulierter tRNA-Modifikationen unserer Ansicht nach nicht nur für die Translationskontrolle selbst relevant, sondern auch wichtig zum Verständnis von neurogenerativen Prozessen in höheren eukaryontischen Modellen inklusive unserer eigenen Zellen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen