Durchflusszytometer
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Bestimmung der Signalaktivität vom B-Zellrezeptor (BCR) (Arbeitsgruppe Prof. Dr. H. Jumaa): Die Entstehung und Aktivierung der B-Lymphozyten sind streng regulierte Prozesse, die bei Fehlregulation zu unkontrollierter Zellteilung und maligner Transformation oder Autoimmunerkrankungen führen können. Unsere Projekte zielen darauf, die molekularen Mechanismen, die diese Prozesse regulieren, zu verstehen. Für die Mehrzahl unserer Projekte ist die Bestimmung der Signalaktivität in B Zellen von zentraler Bedeutung. Diese Bestimmung erfolgt über die Messung der Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration. Bei der Chronischen Lymphatischen Leukämie (CLL) vermehren sich z.B. krankhafte B-Lymphozyten in unkontrolliertem Ausmaß und verursachen eine der häufigsten Blutkrebserkrankung in der westlichen Welt. Die Ursache dieser unkontrollierten Zellteilung ist unklar, es wird allerdings angenommen, dass chronische BCR Signale dafür notwendig sind. Bisher wurde vermutet, dass unbekannte körpereigene Substanzen oder Krankheitserreger an den BCR binden und dadurch die unkontrollierte Zellteilung der CLL B-Lymphozyten aktivieren. Wir konnten zeigen, dass die BCRs auf CLL B-Lymphozyten ungewöhnliche Eigenschaften haben, durch die eine zellautonome, Antigen-unabhängige Aktivierung möglich wird. Interne Bereiche der Rezeptoren auf CLL B-Lymphozyten sind so geformt, dass sie wie Schlüssel und Schloss zueinanderpassen, wodurch sich benachbarte Rezeptoren derselben Zelle gegenseitig erkennen und die unkontrollierte Teilung der CLL B-Lymphozyten aktivieren. Die gegenseitige Rezeptorerkennung wurde in kristallographischen Untersuchungen ermittelt und in lebenden Zellen bestätigt. Bei den Untersuchungen an lebenden Zellen wird die autonome Signalaktivität der B-Zellrezeptoren über die Bestimmung der Kalziumkonzentration bestimmt. Unsere Arbeitsgruppe ist weltweit die einzige, die über ein geeignetes System für die Bestimmung autonomer Signale verfügt. Für dieses System sind Messungen am LSR erforderlich. In analogen Experimenten untersuchen wir die Rolle der konstanten Region des BCR. Wir konnten zeigen, dass die konstante Region sowohl die autonome als auch die Antigen-abhängige Signalaktivierung beeinflusst. Auch dafür sind Messungen am LSR erforderlich. Das Gerät wurde von der Arbeitsgruppe “Molekulare Immunologie” (AG-Leiter: Prof.Dr.Hans Jörg Fehling) des Instituts für Immunologie vor allem zur Bearbeitung von 2 Projekten intensiv genutzt: Projekt 1: Charakterisierung hämatopoetischer Stamm- und Progenitorpopulationen Mll5-defizienter Mausmutanten, sowie mehrerer Doppelmutanten (Mll5/Ifnar, Mll5/Ink4a, Mll5/Bid, Mll5/Tmem173). Mll5-defiziente Mäuse haben hämatopoetische Stamm- und Progenitordefekte und sind strahlenempfindlich. Unsere Arbeiten haben die molekularen Mechanismen, die diesen Defekten zu Grunde liegen, untersucht und einen bis dahin unbekannten Reaktionsweg aufgeklärt. So konnten wir zeigen, dass der Verlust von Mll5 zu DNA-Doppelstrangbrüchen und DNA-Reparaturdefekten führt, die eine Typ I Interferonausschüttung verursachen. Über den Typ I Interferon Signalweg werden dann intrazellulär toxische ROS-Konzentrationen induziert (ROS = Reaktive Sauerstoffspezies), die für die hämatopoetischen Stammzelldefekte ursächlich verantwortlich sind. Die Arbeit an diesem Projekt erforderte die zuverlässige Unterscheidung von mindestens 7 Fluoreszenzparametern und die Charakterisierung kleinster Stammzellpopulationen, die nur mit einem leistungsfähigen Durchflusszytometer, wie dem beschafften Gerät, möglich war. Projekt 2: Genetische Markierung lymphatischer Vorläuferstadien: In vivo „fate mapping“ mit pTa/iCre und Gata3/vYFP „knock-in“ Mäusen. GATA-3 ist ein Transkriptionsfaktor, der in der T-Lymphopoese eine essenzielle Rolle spielt. Um extra-thymische T-Zellvorläufer nicht-invasiv detektieren zu können, haben wir in den endogenen Gata3 Genlokus eine cDNA inseriert, die das fluoreszierende Protein Venus Yellow Fluorescent Protein (vYFP) kodiert. Mit Hilfe des beschafften Durchflusszytometers konnten wir kleinste, Gata3-exprimierende Zellpopulationen in Knochenmark, Thymus und sekundären lymphatischen Organen identifizieren und umfassend charakterisieren. Einzelne Datensätze wurden einem Kooperationspartner (Prof. Dr. Rudi W. Hendriks/Rotterdam) zur Verfügung gestellt. Vor allem dank der Qualität der Zytofluorometrie-Daten, die in diesen Vorarbeiten gewonnen wurden, konnten außerdem erfolgreich DFG-Drittmittel eingeworben werden. Ohne regelmäßigen Zugang zu einem Hochleistungs-Durchflusszytometer, wie dem beschafften Gerät, wären diese Erfolge nicht möglich gewesen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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DNA damage-induced HSPC malfunction depends on ROS accumulation downstream of IFN-1 signaling and Bid mobilization. Cell Stem Cell 19 [2016], 752
Tasdogan A, Kumar S, Allies G, Bausinger J, Beckel F, Hofemeister H, Mulaw M, Madan V, Scharffetter-Kochanek K, Feuring-Buske M, Doehner K, Speit G, Stewart AF, Fehling HJ
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Distinct homotypic B-cell receptor interactions shape the outcome of chronic lymphocytic leukaemia. Nat Commun. 2017 Jun 9;8:15746
Minici C, Gounari M, Übelhart R, Scarfò L, Dühren-von Minden M, Schneider D, Tasdogan A, Alkhatib A, Agathangelidis A, Ntoufa S, Chiorazzi N, Jumaa H, Stamatopoulos K, Ghia P, Degano M
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Group 2 innate lymphoid cells exhibit a dynamic phenotype in allergic airway inflammation. Front. Immunol. 8 [2017], 1684
Li BWS, Stadhouders R, de Bruijn MJW, Lukkes M, Beerens DMJM, Brem MD, Kleinjan A, Bergen I, Vroman H, Kool M, van Ijcken WFJ, Rao TN, Fehling HJ, Hendriks RW
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Pathogen-specific B-cell receptors drive chronic lymphocytic leukemia by light-chain-dependent cross-reaction with autoantigens. EMBO Mol Med. 2017 Nov;9(11):1482-1490
Jiménez de Oya N, De Giovanni M, Fioravanti J, Übelhart R, Di Lucia P, Fiocchi A, Iacovelli S, Efremov DG, Caligaris-Cappio F, Jumaa H, Ghia P, Guidotti LG, Iannacone M
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The IFN-1 > BID > ROS pathway: Linking DANN damage with HSPC malfunction. Cell Cycle 16 [2017], 819
Gross A, Tasdogan A, Fehling HJ
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Antihomotypic affinity maturation improves human B cell responses against a repetitive epitope. Science. 2018 Jun 22;360(6395):1358-1362
Imkeller K, Scally SW, Bosch A, Martí GP, Costa G, Triller G, Murugan R, Renna V, Jumaa H, Kremsner PG, Sim BKL, Hoffman SL, Mordmüller B, Levashina EA, Julien JP, Wardemann H.
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B-Cell-Specific Diversion of Glucose Carbon Utilization Reveals a Unique Vulnerability in B Cell Malignancies. Cell. 2018 Apr 5;173(2):470-484
Xiao G, Chan LN, Klemm L, Braas D, Chen Z, Geng H, Zhang QC, Aghajanirefah A, Cosgun KN, Sadras T, Lee J, Mirzapoiazova T, Salgia R, Ernst T, Hochhaus A, Jumaa, H, Jiang X, Weinstock DM, Graeber TG, Müschen M
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Epigenome analysis links gene regulatory elements in group 2 innate lymphocytes to asthma susceptibility. J.Allergy Clin.Immunol. 2018 Mar 2. pii: S0091-6749(18)30295-1
Stadhouders R, Li BWS, de Bruijn MJW, Gomez A, Rao TN, Fehling HJ, van Ijcken WFJ, Lim AI, Di Santo JP, Graf T, Hendriks RW
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PI3K induces B-cell development and regulates B cell identity. Sci Rep. 2018 Jan 22;8(1):1327
Abdelrasoul H, Werner M, Setz CS, Okkenhaug K, Jumaa H
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PI3K-Mediated Blimp-1 Activation Controls B Cell Selection and Homeostasis. Cell Rep. 2018 Jul 10;24(2):391-405
Setz CS, Hug E, Khadour A, Abdelrasoul H, Bilal M, Hobeika E, Jumaa H.
