Modified multivalent poly-N-acetyllactosamine glycans as novel ligands of human galectin-3
Final Report Abstract
Im gemeinsamen DFG-GACR Projekt wurden von der Elling und Křen Gruppe neuartige Strategien für die Synthese einer Bibliothek von multivalenten Glykokonjugaten entwickelt und neue potente Inhibitoren für das humane Galectin-3 (Gal-3) identifiziert. Mittels kombinatorischer Biokatalyse mit Glykosyltransferasen und Transglykosidasen wurden poly-N-acetyllactosamin (LacNAc) basierte Glykane mit terminalen Typ 2 LacNAc (Galβ4GlcNAc), N,N’-diacetyllactosamin (LacdiNAc), Typ 1 LacNAc (Galβ3GlcNAc) und Galili (Galα1,3Gal) Epitopen synthetisiert. Chitooligomere wurden weiterhin als Abstandshalter mit einer Transglycosidase eingeführt, um die Zugänglichkeit der Glykanepitope für die Bindung von Gal-3 zu untersuchen. Die Kombination von Galactose Oxidase und reduktiver Aminierung ergab terminal biotinylierten poly-LacNAc und erstmalig verzweigte Lac(di)NAc Glykanstrukturen. Ein sehr wichtiges Ergebnis war die multivalente Präsentation der modifizierten poly-LacNAc Glykane auf der Basis eines von der Elling Gruppe bereits etablierten Protokolls zur chemischen Konjugation der Glykane mit Rinderserumalbumin (BSA). Zusammenfassend wurde eine Bibliothek von monovalenten poly-LacNAc Glykanen und multivalenten Neo-Glykoproteinen für deren Evaluation als Inhibitoren des humanen Gal-3 erhalten. Gal-3 steht derzeit als Biomarker von Krebs- und Fibroseerkrankungen und als Ziel für theranostischen Anwendungen im Fokus der biomedizinischen Forschung. Bindungsstudien mit Enzyme-Linked-Lectin-Assays (ELLA) und Surface Plasmon Resonance (SPR) Experimenten ergaben neuartige potente Gal-3 Liganden und Inhibitoren. In der Serie der monovalenten Glykane wurde das verzweigte Glykan mit zwei LacdiNAc-LacNAc Zweigen als zurzeit effizientester Inhibitor von Gal-3 auf der Basis von poly-LacNAc identifiziert (IC50 ~3 µM). Die multivalente Präsentation der poly-LacNAc basierten Epitope auf BSA steigerten signifikant das inhibitorische Potential für Gal-3. Das LacdiNAc Epitop präsentierende Neo- Glykoprotein wies einen IC50 Wert im nanomolaren Bereich auf. Das LacdiNAc Neo- Glykoprotein war höchst selektiv für die Bindung von Gal-3 im Vergleich zu Gal-1, selbst aus Blutserumproben. Dies könnte in einem neuartigen Diagnostiktest für den Nachweis von Gal-3 aus Serumproben von Krebspatienten genutzt werden. Weiterhin, wurde durch Kombination von Neo-Glykoproteinen mit LacdiNAc und biotinylierten LacNAc Epitopen ein neuartiger Antikörper-freier Nachweistest für Gal-3 entwickelt. SPR Experimente bestätigten die geschilderten Resultate zur Gal-3 Bindung. Schließlich wurden anhand von dynamischen molekularen Simulationsstudien die freien Bindungsenergien der LacdiNAc-LacNAc und LacNAc-LacNAc Epitope in der Bindungstasche (carbohydrate recognition domain, CRD) von Gal-3 verglichen. Hier wurde Asp148 als stabilisierende Aminosäure für die LacdiNAc Bindung identifiziert. In Kooperation mit Prof. Dr. Roland Pieters (Utrecht University), wurde weiterhin erstmals das Thiodigalactosid (TDG) auf BSA multivalent präsentiert. Das resultierende Neo- Glykokonjugat ist mit einem IC50 Wert von 2 nM 4.800-fach potenter als der monovalente Ligand und damit eines der potentesten multivalenten Gal-3 Inhibitoren. Wir schlussfolgern aus unseren Projektergebnissen, dass die multivalente Präsentation von modifizierten poly-LacNAc Glykanen auf Serum Neo-Glykoproteinen der Schlüssel für potente Galektininhibitoren ist. Dies öffnet die Möglichkeit Galektine im vaskulären System zu inhibieren. Für solche Studien stehen nun hochpotente multivalente Inhibitoren zur Verfügung.
Publications
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