Light Sheet Mikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Mit Hilfe der Light-Sheet-Mikroskopie lassen sich Prozesse in sehr großen Regionen mit nahezu isotroper 3D-Auflösung darstellen und in vitalen Geweben über die Zeit verfolgen. Die Herausforderung besteht in der Etablierung geeigneter Versuchsanordnungen, die (i) Lichtbrechungseffekte an Grenzflächen zwischen Medien mit unterschiedlichem Brechungsindex minimieren, (ii) eine hohe Eindringtiefe bei geringer Lichtstreuung ermöglichen als auch (iii) Gewebefragmente und Organismen unter den Experimentalbedingungen in vollständiger Funktionsfähigkeit erhalten. Die notwendigen Optimierungsexperimente sind ausgesprochen aufwändig und erfordern ein hohes Maß an experimenteller Geschicklichkeit. Wir haben daher einen Großteil der Berichtszeit mit diesen Arbeiten verbracht. Dies betraf (i) die Verbesserung von Klärtechniken für die Untersuchung von fixierten Geweben (in Zusammenarbeit mit Prof. Marc Spehr, RWTH Aachen), (ii) die Anpassung von Agarose-basierten Kammern für 3D-Kulturen, (iii) die Austestung von geeigneten Fluorophorkombinationen, (iv) die Minimierung von Phototoxizität und (v) die Einstellung von Bedingungen für Langzeitbeobachtung vitaler Embryonen und Gewebefragmente. Mit den optimierten Bedingungen gelang: die Darstellung subzellulärer Strukturen während der Invasion von Trophoblasten in endometriale Drüsenepithelien unter Verwendung eines Zellkultursystems der humanen Embryoimplantation; die Analyse des Aufbaus von Zellkontakt-verankerten Zytoskelettelementen während der Embryogenese im genetischen Modellorganismus Caenorhabditis elegans; die 3D-Rekonstruktion der Kernanordnung in großen Gewebefragmenten wildtypischer und mutierter Mausherzen; die vergleichende Analyse der Rekrutierung von spezifischen T-Zellpopulationen in vitalen Lungenfragmenten von wildtypischen und asthmatischen Mäusen; die Darstellung der Wechselwirkung von funktionalisierten, fluoreszierenden Mikrogelen mit den Epithelien der Darmschleimhaut unter Verwendung von Reportermäusen, in denen das Keratinzytoskelett durch einen Knock-In mit einem fluoreszierenden Marker versehen ist; die Analyse der Differenzierung Stammzell-abgeleiteter Embryonalkörper im 3D-Kontext; die hochauflösende isotrope Darstellung der Glomeruli-Anordnung im Bulbus olfactorius der Maus; das in vivo Monitoring der Hitzestress-induzierten nukleären Translokation von DAF-16::YFP in den Darmzellen von Caenorhabditis elegans; die Optimierung einer Chemotaxiskammer zur Langzeitbeobachtung der 3D-Zellmigration in einem stabilen chemischen Gradienten; und die Untersuchung der Wurzelhaare in Nutzpflanzenkeimlingen. Zudem wurde das Mikroskop in einem internationalen Workshop eingesetzt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Demonstrating Improved Multiple Transport‐Mean‐Free‐Path Imaging Capabilities of Light Sheet Microscopy in the Quantification of Fluorescence Dynamics. Biotechnology Journal, 13(1).
Rieckher, Matthias; Psycharakis, Stylianos E.; Ancora, Daniele; Liapis, Evangelos; Zacharopoulos, Athanasios; Ripoll, Jorge; Tavernarakis, Nektarios & Zacharakis, Giannis
