Atomares Kraftmikroskop (AFM)
Final Report Abstract
Das Aggregationsverhalten roter Blutzellen wurde untersucht und die Bindungsenergien bestimmt. Die roten Blutzellen aggregieren in Stasis aufgrund der im Blutplasma enthaltenen Proteine infolge des „Depletion“-Effekts was zu der prononcierten Scherverdünnung von Blut führt. Bei den Adhäsionsmessungen wurde das AFM auch wie geplant mit einem konfokalen Mikroskop gekoppelt und die Deformation der roten Blutzellen bei der Aggregation und der Dissaggregation untersucht. Ein rheologischer Ansatz unter Verwendung eines kommerziellen Rheometers beinhaltet die Viskositätsnormierung als Funktion der Adsorptionsraten von Makromolekülen. Hiervon abgeleitet werden die Fließspannung von Suspensionen aggregierter roter Blutzellen untersucht. Detaillierte mikroskopische Studien der Morphologie von Interaktionszonen aggregierter roter Blutzellen zeigen eine starke Abhängigkeit von der molekularen Konzentration, was gut mit numerischen Simulationen, die eine Annäherung an die Interaktionsenergien zulassen, übereinstimmt. Letztere wurden direkt mit Einzelzellkraftmikroskopie unter Verwendung eines Atomkraftmikroskops gemessen. Die Steifigkeit roter Blutzellen nach Zugabe von Gluteraldehyde wurde mit dem AFM charakterisiert und es konnte gezeigt werden, dass sich die Steifigkeit über einen breiten Bereich einstellen lässt. Daran im Anschluss wurden Messungen zur Margination, d.h. zum diffusionsverhalten steifer Blutzellen in einer mikrofluidischen Strömung von gesunden Blutzellen durchgeführt und dabei erstmals das dreidimensionale Margniationsverhalten in der Blutströmung charakterisiert. Die viskoelastischen Eigenschaften von murinen Immunezellen wurden mit dem AFM in Abhängigkeit spezifischer zytoskeletaler Elemente (speziell Intermediäre Filamente) gemessen. Da Immunzellen nicht stark adhärieren wurde dafür ein neuartiges Verfahren genutzt, um den Cantilever so zu verändern, dass er parallel auf die Zellen eindrückt, um sie auf diese Art während der Messung zu immobilisieren. Wir konnten damit nachweisen, dass Immunzellen ohne das Intermediäre Filament Vimentin signifikant weicher als die entsprechenden Kontrollzellen sind, welches eine mechanistische Erklärung für davor stattgefundene Migrationsexperimente liefert. Die Mechanik von nicht-adhärierten Zellen wurde mit Hilfe des AFMs mit der Mechanik von adhärenten Zellen verglichen, sowohl im biochemischen Normalzustand als auch nach der Inhibition des molekularen Motors Myosin II. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass sich der Aktin Kortex von suspendierten Zellen signifikant von dem Kortex von adhärierten Zellen unterscheidet. Gelatine-Nanopartikel als Wirkstoffträger für makromolekulare Wirkstoffe (Peptide, Proteine) sollen hinsichtlich ihrer Elastizität untersucht werden. Die Elastizität wird im Hinblick auf die biologische Interaktion und die zelluläre Aufnahme, aber auch die Verteilung im Organismus benötigt. Dafür sollen unterschiedliche gecrosslinkte (mit Glutaraldehyd) Nanopartikel von ca 300 nm Durchmesser untersucht werden. Neben dem Einfluss der Herstellung hat sich vor allem die Lagerungsdauer als wichtiger Parameter für die Steifigkeit gezeigt. Gealterte Partikel zeigen eine höhere Steifigkeit als frische Partikel. Diese Ergebnisse wurden mit Hilfe der Indentationsmethode bestimmt und auch mit Zellaufnahme Studien abgeglichen.
Publications
- Clusters of red blood cells in microcapillary flow: hydrodynamic versus macromolecule induced interaction. Soft Matter 12, 8235-8245 (2016)
V. Clavería, O. Aouane, M. Thiébaud, M. Abkarian, G. Coupier, C. Misbah, T. John, and C. Wagner
(See online at https://doi.org/10.1039/C6SM01165A) - The buckling instability of aggregating red blood cells. Scientific Reports 7, 7928 (2017)
D. Flormann, O. Aouane, L. Kaestner, C. Ruloff, C. Misbah, T. Podgorski and C. Wagner
(See online at https://doi.org/10.1038/s41598-017-07634-6)
