Erhöhte Aktivität des alternativen non-homologous end joining (A-NHEJ) als möglicher Mechanismus von chromosomalen Aberrationen im Pankreaskarzinom.

• Antragsteller: Dr. Patryk Moskwa
• Fachliche Zuordnung: Gastroenterologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 269137599

Obwohl chromosomale Aberrationen ein Merkmal aller malignen Tumoren sind, ist deren Entstehungsmechanismus ungeklärt. Das klassiche NHEJ (cNHEJ) ist ein Reparaturmechanismus von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) und dessen Fehlfunktion verursacht chromosomale Aberrationen, möglicherweise durch das kompensatorische alternative NHEJ (aNHEJ). Die Komponenten des aNHEJ sind unbekannt und die durch das aNHEJ vermittelten Reparaturstellen der DSB tragen Mikrohomologien.Eine einzelne miRNA hat die Fähigkeit, die Gene von einem bzw. mehreren Signalwegen gleichzeitig zu regulieren. Somit sind miRNAs ideale Kandidaten, um das Gleichgewicht zw. cNHEJ und aNHEJ zu deregulieren.Ziel 1: Identifizierung von miRNAs, die das cNHEJ supprimieren.Analog zu Moskwa et al. wurden bereits 6 miRNAs, die das möglicherweise cNHEJ regulieren, entdeckt. Im ersten Schritt wird deren Wirkung auf das cNHEJ mittels eines genom-integrierten cNHEJ Reporter- und im Luciferase-Assay verfifiziert. Für die bereits untersuchte miR-142 wurden viel versprechende Ergebnisse erhalten. Anschließend wird die Auswirkungen dieser miRNAs auf die DNA-Reparaturkapazität und -kinetik nach gamma-Irradiation (gIR) untersucht und auf die Empfindlichkeit auf gIR, PARP Inhibitoren und Bleomycin bestimmt. Um die in vivo Relevanz der miRNA zu bestätigen, werden chromosomale Aberrationen in pankreatischen Zelllinien und primären Pankreastumoren auf Mikrohomologien sequenziert sowie die Expression der miRNAs und deren Zielproteine untersucht. Wir erwarten eine inverse Korrelation zwischen miRNAs und deren Zielproteinen sowie eine direkte Korrelation mit den Mikrohomologien.Ziel 2. Identifizierung von Komponenten des aNHEJ.Eine erhöhte aNHEJ Aktivität wird durch spezifische KrasG12D Expression im Pankreas (Mausmodell) und mittels shRNA-Ku70 (ein Schlüsselprotein des cNHEJ) ex vivo in isolierten Azinuszellen induziert und die Geneexpression mit Microarray untersucht. Gene, die unter beiden Bedingungen hochreguliert sind, werden als Kandidaten des aNHEJ bewertet. Anhand der Literatur, The Gene Onthology und unter Bevorzugung der Top 20 Gene werden max. 50 Gene selektiert, deren Wirkung auf das aNHEJ mitells siRNA in Zellen mit genom-integrierten aNHEJ Reporterassay getestet werden. Anschließend wird die Rolle der Kandidatgene in der DNA Reparaturkapazität und -kinetik nach gIR untersucht. Die 3 wirkungsvollsten Kandidaten werden ausgewählt und deren Wirkung auf die Empfindlichkeit gegenüber gIR, PARP Inhibitoren und Bleomycin bestimmt.Um die in vivo Relevanz zu etablieren, wird die Expression der Kandidatgene im KrasG12D/p48 Pankreastumor Mausmodell sowie in humanen Pankreastumoren untersucht. Um die therapeutische Bedeutung zu evaluieren, werden mit Nanopartikel, die mit spezifischen siRNA beladen sind, die Zielproteine in dem Pankreastumor Mausemodell supprimiert und deren Auswirkung alleine oder in Kombination mit Bleomycin und PARP Inhibitor auf Tumorwachstum/Metastasierung untersucht.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen