Biotechnological evaluation of temperature induced gene expression and metabolome modulation of self-cloning Saccharomyces yeast
Plant Cultivation, Plant Nutrition, Agricultural Technology
Final Report Abstract
Die Saccharomyces Hefen stellen aufgrund ihrer kurzen Generationsphase und einfachen Handhabung den bedeutendsten eukaryotischen Modellorganismus für die molekularbiologische und pharmakologische Forschung dar. Ebenso sind Saccharomyces Hefen an mannigfachen Prozessen in der Lebensmittelindustrie beteiligt. Diese Hefen sind an die im Herstellungsprozess von Getränken und Lebensmitteln auftretenden Umwelteinflüsse adaptiert und deren Stoffwechselvorgänge in den jeweiligen Herstellungsprozessen zudem umfassend untersucht. Die an der Produktion hefefermentierter Getränke beteiligten Saccharomyces Hefen unterliegen verschiedenen Stressoren wie Temperatur, osmotischer Druck, Sauerstoff- und Nährstoffmangel, die eine starke Regulation der am Metabolismus beteiligten Enzyme bzw. Gene mit sich führen können. In dem Projekt wurde diese Induktion der Genexpression gezielt über prozesstechnische Variationen durch bewusst herbeigeführte Stressinduktionen hervorgerufen. Dazu wurde im ersten Teil ein Hochdurchsatzverfahren zur Evaluierung der Induktionskonditionen von nativen Promotoren der Hefe Saccharomyces cerevisiae Stamm TUM 68 unter industriellen Bedingungen entwickelt. Mittels des grün fluoreszierenden Proteins EGFP und dessen Fluoreszenzdetektion war es möglich, die Promotoraktivität zeitnah und nicht invasiv zu detektieren. Im Weiteren wurden zehn native Promotoren verschiedener stressinduzierter Gene der untergärigen Hefe Saccharomyces pastorianus Stamm TUM 34/70 mit der validierten Methode evaluiert. Dabei wurde neben verschiedener Kälteschock-Szenarien und Ethanolkonzentrationen auch die Induktion während der Fermentation ohne gezielte Induktion untersucht. Die drei Promotoren PSSA3, PHSP104 und PUBI4 zeigten dabei die effektivsten Induktionseigenschaften. Das Gen ATF1, welches produktoptimierende Eigenschaften bezüglich der Biosynthese der Aromastoffe Ethylacetat und Isoamylacetat besitzt, wurden anschließend unter die Kontrolle der evaluierten Promotoren gebracht. Unter industrienahen Bedingungen zeigten die selbstklonierten Hefen mit den regulierten Promotoren PUBI4 und PHSP104 einen signifikant höhere Konzentration an Ethylacetat nach dem Temperatursprung von 12 °C auf 4 °C, was eine gezielte Induktion durch die prozesstechnische Variation der Temperatur belegt. Im nicht flüchtigen Hefemetabolom konnten bei den Primärmetaboliten keine signifikanten quantitativen Unterschiede im Zuge des Temperaturschocks der gentechnisch veränderten Hefe beobachtet werden. Hingegen waren die im Zuge des Ehrlichabbaus (Aminosäure - > Ketosäure -> Aldehyd -> Alkohol -> Ester) gebildeten 2-Oxosäuren und Aldehyde nach Anschalten des Promotors PUBI4 signifikant erniedrigt. Dies weist darauf hin, dass die im Zuge des Ehrlichabbaus gebildeten Fuselalkohole durch die Alcohol O-acetyltransferase 1 katalysierte Veresterung aus dem metabolischen Gleichgewicht entzogen werden.
Publications
- Induced gene expression: Evaluation of temperature and ethanol inducible native promoters for self-cloning brewing yeast. Belgian Brewing Conference 2015, Leuven, Belgium, 2015-09-06
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