Modularisierung des Typ III-Sekretionssystems des pflanzenpathogenen Bakteriums Xanthomonas campestris pv. vesicatoria für funktionelle Studien und Proteintransport

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Professorin Dr. Daniela Büttner; Dr. Sylvestre Marillonnet
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Mikrobielle Ökologie und Angewandte Mikrobiologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2015
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 269267294

Das Gram-negative pflanzenpathogene Bakterium Xanthomonas campestris pv. vesicatoria transloziert mit Hilfe eines Typ III-Sekretionssystems (T3S-Systems) Effektorproteine in Pflanzenzellen. T3S-Systeme sind essentielle Pathogenitätsfaktoren der meisten Gram-negativen pflanzen- und tierpathogenen Bakterien und sind aus einem membranständigen Sekretionsapparat aufgebaut, der mit einem extrazellulären Pilus sowie einem Translokon in der eukaryotischen Plasmamembran assoziiert ist. In der letzten Förderperiode haben wir durch Assemblierung aller genetischen Elemente mit Hilfe des Golden Gate-basierten modularen Klonierungssystems MoClo ein funktionales modulares T3S-System von X. campestris pv. vesicatoria generiert. Das modulare T3S-Gencluster ermöglicht den schnellen und effizienten Austausch einzelner Gene oder Operons und erleichtert damit funktionelle Studien und die Analyse von Reporterfusionen. So wurde in der letzten Antragsperiode mit Hilfe des modularen T3S-Genclusters die Assemblierung eines Fluoreszenz-markierten Derivates der vorhergesagten cytoplasmatischen (C) Ringkomponente des T3S-Systems, HrcQ, analysiert. Die experimentellen Studien zeigten, dass die effiziente Assemblierung des C-Rings vom ATPase-Komplex und dem bislang nicht charakterisierten HrpB4-Protein abhängig ist.Ziel des vorgeschlagenen Projektes ist die Optimierung des modularen T3S-Systems für funktionelle Studien von T3S-Systemkomponenten und für die Etablierung als Proteintransportsystem. Im ersten Teil des Projektes soll die Assemblierung des Sekretionsapparates mit Hilfe von Fluoreszenz-markierten cytoplasmatischen und Membran-assoziierten T3S-Systemkomponenten analysiert werden. Zusätzliche in vivo- und in vitro-Interaktionsstudien sollen zur Aufklärung des Aufbaus der bislang nicht charakterisierten cytoplasmatischen Sortierungsplattform des T3S-Systems beitragen. Fokus des zweiten Teils des vorgeschlagenen Projektes ist die Reassemblierung von modifizierten Operons des T3S-Genclusters, wobei überlappende Sequenzen in den einzelnen Gen-Modulen vermieden und daduch funktionelle Studien einzelner Gene erleichtert werden sollen. Die Assemblierung optimierter Einzelmodule soll mit Hilfe einer modifizierten Version des MoClo-Systems erfolgen, welche die Insertion von Ribosomenbindestellen stromaufwärts einzelner Gene und damit die Optimierung der Genexpression ermöglicht. Durch diese Vorgehensweise soll außerdem im dritten Projektteil die T3S-Genexpression nach Transfer des modularen T3S-Genclusters in andere Bakterienspezies optimiert werden. Langfristiges Ziel dieser Arbeiten ist die Etablierung eines heterologen T3S-Systems von X. campestris pv. vesicatoria für den Proteintransport in pflanzliche Zellen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen