Amyloid Precursor Protein abhängige Entstehung von Kernaggregaten in aus Gen-editierten iPSC Zellen differenzierten Neuronen

• Antragsteller: Privatdozent Dr. Thorsten Müller
• Fachliche Zuordnung: Experimentelle Modelle zum Verständnis von Erkrankungen des Nervensystems ; Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 270451600

Das amyloide Vorläuferprotein (APP) ist von zentraler Relevanz für die Pathophysiologie der Alzheimer Erkrankung. Die c-terminale Domäne des Proteins ist in einen Signal-Weiterleitungs-Mechanismus mit bis dato unbekannter Funktion involviert. Resultierend aus der Spaltung des APP oder Phosphorylierungsänderungen wird das Adapter Protein FE65, das normalerweise Membran-ständig an die c-terminale APP Domäne gebunden ist, in den Zellkern transportiert und ist dort für die Entstehung eines Kernkomplexes verantwortlich. Der Komplex, an dem weitere Proteine beteiligt sind, für die eine Funktion bei der DNA Reparatur oder Replikation beschrieben wurde, ist hoch dynamisch und die zunächst kleinen Aggregate fusionieren bis zur Entstehung großer rundlicher Strukturen bevor es schließlich zu einem Absterben der betroffenen Zelle kommt.Im Rahmen des jetzt beantragten Vorhabens sollen neue Methoden der Stammzellbiologie, der Gen-Editierung und der Konfokal-Mikroskopie vereint werden, um so den Mechanismus der FE65 Translokation in den Zellkern sowie die Funktion des resultierenden Kernkomplexes für Neurone zu verstehen. Dazu werden wir humane induzierbare pluripotente Stammzellen mittels Gen-Editierung so verändern, dass das Protein FE65 mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert wird. In den nachfolgenden Experimenten werden die editierten Linien in neuronale Zellen differenziert, um in diesen dann die subzelluläre FE65 Lokalisation als Funktion der veränderten APP Prozessierung bzw. Phosphorylierung zu untersuchen. Darüber hinaus wird die FE65 Gen Editierung auch auf bereits etablierte mutante APP Stammzelllinien angewandt, um den Einfluss familiärer APP Mutationen auf die FE65 Translokation zu analysieren. Nach unserem Kenntnisstand entspricht das beschriebene Modell dem bis dato best-möglichen Ansatz, Signalwege mittels mikroskopischer Methoden so gering artifiziell wie möglich zu untersuchen. Die Zusammensetzung des FE65 abhängigen Kernkomplexes wird weitergehend analysiert um Rückschlüsse auf deren Funktion zu erhalten. Die Relevanz des Komplexes für die generelle Integrität des Zellkerns zu untersuchen, ist weiterer Bestandteil der geplanten Arbeiten, wofür eine weitere Stamm-Zelllinie etabliert werden soll, die neben dem beschriebenen FE65 auch ein Kernhüllen Protein mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert. Veränderungen der Kernumhüllung werden aktuell als frühe Veränderung im Rahmen der Alzheimer Pathophysiologie diskutiert und erste Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe in FE65 über-exprimierenden Zellen zeigten auffällige Kern Einstülpungen. Die geplanten Projektarbeiten haben damit das Potential, einen APP/FE65 abhängigen Signalweg mit Relevanz für neurodegenerative Mechanismen im Rahmen der Alzheimer Erkrankung aufzuschlüsseln.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen