Die molekularbiologische Aufklärung von Histondeacetylase-Inhibitor-Wirkmechanismen an humanen Keimzelltumor-Zelllinien in vitro und in vivo

• Antragsteller: Professor Dr. Daniel Nettersheim
• Fachliche Zuordnung: Pathologie ; Hämatologie, Onkologie
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 270478324

Unsere Vorarbeiten haben gezeigt, dass ISTODAX bei sehr geringen Konzentrationen zu einer Hyperacetylierung der Histone H3 und H4 führt sowie Apoptose und einen G2/M-Arrest in Keimzelltumor (KZT)-Zelllinien auslöst. In humanen Fibroblasten konnte nur ein G2/M-Arrest, aber keine Apoptose nachgewiesen werden. Zudem konnten durch unsere Vorarbeiten putative Schlüsselmoleküle einer zellulären ISTODAX-Antwort in CDDP-resistenten und -sensitiven KZT-Zelllinien sowie humanen Fibroblasten identifiziert werden. Wir postulieren, dass die Herabregulation des SWI/SNF-Regulators ARID1A sowie die Heraufregulation der Stress-Sensoren GADD45B, ATF3, ID2, ZFP36 und DUSP1 in KZT-Zelllinien Apoptose induziert. Des Weiteren konnten wir fünf Gene identifizieren die sowohl in KZT-Zellen als auch Fibroblasten heraufreguliert wurden (DHRS2, RHOB, CRISPLD2, BAIAP2 und p21). Wir vermuten, dass einer dieser Faktoren p21 induziert und damit für den G2/M-Arrest verantwortich ist. In dieser Studie soll durch gezielte Überexpression/Herunterregulation dieser Gene mittels cDNA-codierender Plasmide und der CRISPR/Cas-Technik sowie anschließender molekularbiologischer Untersuchung die hierarchische Organisation der ISTODAX-Kaskade und die zelluläre Funktion der Schlüsselmoleküle in KZT-Zellen und Fibroblasten aufgeklärt werden. Expressionsveränderungen werden dabei durch qRT-PCR sowie Western Blot erfasst und putative Protein-DNA- und Protein-Protein-Interaktionen durch Chromatin-Immunopräzipitation oder Co-Immunopräzipitation nachgewiesen. Eine mögliche Apoptose-Induktion und Veränderungen des Zellzyklus werden durch FACS-basierte Verfahren erfasst. Zusätzlich werden Luziferase-exprimierende-, cDNA-Überexpressions- und CRISPR/Cas-Zelllinien in die Tubuli Seminiferi von Nacktmäusen injiziert. Zum einen wird das Tumorwachstum unter einer zwei monatigen ISTODAX-Therapie mittels Live Imaging-Technologie erfasst und zum anderen werden die Tumoren einer molekularbiologischen Untersuchung nach zuvor beschriebenen Vorbild unterzogen. Die Daten werden anschließend mit den in vitro gewonnen Erkenntnissen verglichen. Durch diese Experimente wird der ISTODAX-Wirkmechanismus detailliert in vitro und in vivo aufgeklärt und es können wichtige Erkenntnisse auf das Ansprechverhalten der KZT-Zellen auf eine ISTODAX-Behandlung gezogen werden, die den Therapieerfolg beeinflussen könnten. Zudem kann durch die Tubuli Seminiferi-Injektionen geprüft werden, ob ISTODAX die Blut-Hoden-Schranke überwinden kann und sich somit als KZT-Therapeutikum in vivo eignet.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen