Template-mediated N-to-C-terminal assembly of peptide chains and cyclic peptides on programmable heterodimeric coiled-coil scaffolds
Final Report Abstract
Coiled-Coils sind α-helicale selbständig faltende Proteinmotive. Man kann sie der Einfachheit halber als dicht gepackte Helixbündel bezeichnen, die sich zu zwei bis sieben α-Helices zusammenlagern. Da das Coiled-Coil zu den am besten verstandenen Proteinfaltungsmotiven gehört, gibt es für alle Oligomerzustände Regeln, nach denen das gewünschte Coiled-Coil- Assemblat vom Reißbrett aus designt werden kann. Für unsere im Projektantrag gesteckten Ziele war vor allem das heterodimere Coiled-Coil intressant, das aus einem A-Strang und einem B-Strang besteht. Dadurch können zwei potenzielle Reaktanden in räumliche Nähe gebracht und die gewünschte Reaktion beschleunigt werden. Ziel des bewilligten Projektes war die Entwicklung Coiled-Coil-vermittelter Synthesemethoden, genauer, einer Coiled-Coil-vermittelten Peptidsynthese nach Vorbild der nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen und einer Coiled-Coil-vermittelten Peptidszyklisierung. Das Konzept der Coiled-Coil-vermittelten Peptidsynthese beinhaltete die Modifikation der Coil-Stränge mit einem Thiollinker (Acyldonorstrang) und einem Dithiollinker (Acylakzeptorstrang). Über den Mechanismus der Native Chemical Ligation wird zunächst eine als Thioester gebundene Aminosäure vom Acyldonorstrang auf eine freie Thiolfunktion im Dithiollinker des Acylakzeptorstrangs übertragen. Durch nachfolgenden S→N-Acyltransfer wird die wachsende Peptidkette auf die gerade transferierte Aminosäure transferiert. Die Dissoziation des nun leeren Acyldonorstrangs kann durch Austausch mit einem weiteren Acyldonorstrang erfolgen. Während der Förderperiode haben wir grundlegende Teilergebnisse zur Realisierung des Projektes erzielt. So haben wir zunächst Strangaustauch in heterodimeren Coiled-Coils in über 100 Coiled-Coil-Paaren untersucht und konnten zeigen, dass für einen präparativ nützlichen Strangaustausch ein KD-Wert-Unterschied von Faktor 10 notwendig ist (Chem. Sci. 2018). Des Weiteren haben wir verschiedene Thiollinker für das zu entwickelte Transfersystem synthetisiert. Primäre Thiole auf dem Acyldonorstrang erwiesen sich dabei als ungünstig, weil der unerwünschte Rücktransfer zu schnell abläuft. Aktuell prüfen wir tertiäre Thiole und N- Hydroxysuccimidyllinker für den Acyldonorstrang, da diese den Rücktransfer nicht begünstigen. Die Coiled-Coil-vermittelte Peptidzyklisierung basiert auf der reversiblen Verankerung des zu zyklisierenden Peptids als Thioester auf einem Coil-Trägerstrang und dessen katalytischer Zyklisierung nach Assoziation des komplementären thiol-modifizierten Coil-Strangs durch Native Chemical Ligation. Die Zyklisierung sollte durch Ausbildung einer Haarnadelstruktur als Intermediat gegenüber der nicht-Coiled-Coil-vermittelten Hintergrundreaktion vereinfacht werden. Problematisch gestaltete sich hier zunächst die Synthese der Konjugate aus Cysteinylpeptidthioester, dem Zyklopeptidvorläufer, und Coilträgerstrang über CuAAC-Click-Reaktion, da der N-terminale Cysteinrest durch das verwendete tert-Butanol als Lösungsmittel unter den CuAAC-Bedingungen formyliert wurde. Über Feinjustierung des Verhältnisses an Kupferspezies und Cu(I)-stabilisierenden THPTA-Liganden konnten die CuAAC-Bedingen optimiert werden. Wir konnten daraufhin zeigen, dass solche Zyklopeptidvorläufer schnell Coiled-Coil-vermittelt zyklisiert werden, und zwar nach dem von uns konzipierten Mechanismus. Allerdings ist die intramolekulare Zyklisierung des Konjugates aus Cysteinylpeptidthioester und Coil-Trägerstrang ebenfalls sehr schnell. Letzteres wollen wir in Zukunft für die Generierung von Zyklopeptidbibliotheken nutzen, da der Coil-Tag sich sehr gut für eine Detektion von Bindungsereignissen in nachfolgenden Bindungsassays eignet.
Publications
- “Decoration of coiled-coil peptides with N-cysteine peptide thioesters as cyclic peptide precursors using CuAAC click reaction”, Org. Lett. 2018, 20, 7493
W. M. Rink, F. Thomas
(See online at https://doi.org/10.1021/acs.orglett.8b03261) - “Kinetic Studies on Strand Displacement in de novo Designed Parallel Heterodimeric Coiled Coils”, Chem. Sci. 2018, 9, 4308
M. C. Groth, W. M. Rink, N. F. Meyer, F. Thomas
(See online at https://doi.org/10.1039/c7sc05342h) - “De novo designed α-helical coiled-coil peptides as scaffolds for chemical reactions”, Chem. Eur. J. 2019, 25, 1665
W. M. Rink, F. Thomas
(See online at https://doi.org/10.1002/chem.201802849)
