Analyse der transkriptionellen und post-transkriptionellen Regulation der humanen iNOS- Expression

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Professor Dr. Hartmut Kleinert; Professorin Dr. Andrea Pautz
• Fachliche Zuordnung: Pharmakologie ; Biochemie ; Immunologie
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 273680753

Das von der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) produzierte NO hat positive anti-virale, anti-parasitäre und anti-onkogene Effekte. Ein überschießende NO-Produktion ist aber auch an der Pathophysiologie vieler Autoimmunerkrankungen (Rheuma etc.), von Krebs oder dem septischen Schock beteiligt. Daher ist es wichtig die Mechanismen zu verstehen, die die iNOS-Expression und die iNOS-abhängige NO-Produktion regulieren.Die iNOS-abhängige NO-Produktion wird durch die Modulation der iNOS-Expression reguliert. Neben der Regulation der Transkription wird insbesondere die humane iNOS-Expression durch verschiedene post-transkriptionelle Mechanismen reguliert. In der 5-untranslatierten Region (5-UTR) findet sich ein kleines offenes Leseraster (µORF). Unsere Daten zeigen, dass dieser µORF translatierbar ist und somit die Translation der iNOS kodierenden Sequnez (cds) hemmen sollte. Jedoch kann nach Induktion in Zellen eine deutliche iNOS Proteinexpression gemessen werden. Unsere Untersuchungen lassen vermuten, dass eine hinter dem µORF zu findende Bindungsstelle für das Poly-A-bindende Protein (PABP) und eine mit dieser Sequenz überlappende putative interne Ribosomen-Bindungsstelle (IRES) für eine Cap-unabhängige Translation der iNOS mRNA wichtig sind. Im Antrag wollen wir die Mechanismen analysieren, die die Translation der iNOS cds trotz µORF ermöglichen. Der 5-UTR der humanen iNOS mRNA wird von Exon 1 und einem Teil der Exon 2 des iNOS-Gens kodiert. Dass Stopcodon des µORF befindet sich 50 bp vor dem Intron 1. Dies deutet auf die Beteiligung des nonsense-mediated mRNA decay (NMD) in der Regulation der humanen iNOS-Expression hin. Eine siRNA-vermittelte Herabregulation der Expression von Upf1, einem zentralen NMD-Mediator, erhöht die iNOS mRNA- und Proteinexpression. Im vorliegenden Antrag wollen wir die Beteiligung des NMD an der Regulation der iNOS-Expression analysieren. Nach Korneev et al. wird in humanen Zellen eine lange nicht-kodierende RNA (lncRNA) mit einer moderaten anti-sense Homologie zum iNOS-Gen exprimiert (as-iNOS-lncRNA). Unsere Daten zeigen, dass die as-iNOS-lncRNA-Expression durch Inkubation von Zellen mit Cytokinen verstärkt wird. Herabregulation der as-iNOS-lncRNA-Expression führt zu einer Senkung der iNOS mRNA- und Proteinexpression. Somit scheint die as-iNOS-lncRNA die iNOS-Expression zu modulieren. Im Antrag wollen wir die Mechanismen dieser Regulation untersuchen. Die iNOS-Expression in humanen C-28/I2-Chondrocyten ist vom Differenzierung-Status der Zellen abhängig. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind nicht bekannt. Neben post-transkriptionellen Effekten könnte dies auch durch Modulation der iNOS-Promotoraktivität zu erklären sein. Unsere Daten zeigen, dass die Induzierbarkeit des iNOS-Promotors in differenzierten C-28I2-Chondrocyten nahezu die der iNOS-mRNA-Expression (> 100-fach) erreicht. Im Antrag wollen wir die Differenzierungs-abhängigen Mechanismen der iNOS-Expression genauer analysieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen