Atropselective synthesis of gossypol by dirigent proteins from cotton
Plant Biochemistry and Biophysics
Final Report Abstract
Dirigentproteinen (DIRs) wird eine wichtige Rolle bei der Biosynthese von Naturstoffen zugeschrieben. Auf weitgehend unverstandene Weise sind sie für die stereochemische Kontrolle von Reaktionen verantwortlich, die in vitro ohne ausgeprägte Regio- und Enantioselektivität verlaufen. Bisher sind DIRs lediglich aus der Lignanbiosynthese bekannt, in Rahmen derer sie die enantioselektive Kupplung zweier Coniferylalkoholradikale zu (+)- oder (-)-Pinoresinol vermitteln. Im Verlauf dieses Projektes wurde untersucht, ob DIRs auch an der Bildung von (+)- und (-)-Gossypol beteiligt sind. Dieser Inhaltsstoff der Baumwolle entsteht durch atropselektive Kupplung zweier Hemigossypolradikale. Es wurden zwei DIRs aus Hochlandbaumwolle (Gossypium hirsutum) und ein DIR aus Pima-Baumwolle (G. barbadense) charakterisiert, die alle die Bildung von (+)-Gossypol vermitteln. Wie zuvor beschriebene DIRs verfügen auch die DIRs der Baumwolle über keine eigene oxidative Aktivität und sind daher auf die Bereitstellung der radikalischen Substratmoleküle durch oxidierende Enzyme (hier eine Laccase) angewiesen. Im Weiteren wurde ein Fed-Batch Fermentationsprozess etabliert, der es erlaubt, zwei DIRs der Baumwolle (GbDIR2 und GhDIR3) in guten Ausbeuten und nahezu homogener Form zu gewinnen. Dies gelang durch Einsatz eines genetisch veränderten Pichia pastoris Stammes, der anders als der Wildtypstamm nicht zur Hyperglycosylierung neigt. Die Glycan-Reste wurden massenspektrometrisch charakterisiert, wobei Glycane mit 5 Mannose-Einheiten mit mehr als 90% aller Glycanmodifizierungen deutlich dominierten. Die Glycane erwiesen sich als nicht essentiell für die Funktion der DIRs. Letztlich gelang es im Rahmen dieses Projektes ein (-)-Pinoresinol-bildendendes DIR, nämlich AtDIR6, zu kristallisieren und seine Struktur aufzuklären. Es zeigte sich, dass dieses DIR entgegen früheren Annahmen über zwei Substratbindetaschen je Untereinheit verfügt, die die aromatischen Ringe der beiden Substratradikale aufnehmen. Dabei werden die Propionylseitenketten der Substrate in einer Weise positioniert, die zu einer regio- (C8-C8‘) und enantioselektiven (re,re) Kupplung führt. Darüber hinaus zeigte die Struktur, dass AtDIR6 auch eine aktive katalytische Rolle bei der Zyklisierung des bei der Kupplung entstehenden bis-Chinon-Intermediates übernimmt. Mit der Identifizierung von DIRs in der Gossypol-Biosynthese und der strukturellen Charakterisierung von AtDIR6 hat dieses Projekt erheblich zu einem besseren Verständnis der Bedeutung und Wirkungsweise dieser interessanten Enzymklasse beigetragen.
Publications
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