Atropselective synthesis of gossypol by dirigent proteins from cotton

• Applicant: Professor Dr. Andreas Schaller
• Subject Area: Biological and Biomimetic Chemistry ; Plant Biochemistry and Biophysics
• Term: from 2015 to 2017
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 273702275

• Final Report Year: 2017

Final Report Abstract

Dirigentproteinen (DIRs) wird eine wichtige Rolle bei der Biosynthese von Naturstoffen zugeschrieben. Auf weitgehend unverstandene Weise sind sie für die stereochemische Kontrolle von Reaktionen verantwortlich, die in vitro ohne ausgeprägte Regio- und Enantioselektivität verlaufen. Bisher sind DIRs lediglich aus der Lignanbiosynthese bekannt, in Rahmen derer sie die enantioselektive Kupplung zweier Coniferylalkoholradikale zu (+)- oder (-)-Pinoresinol vermitteln. Im Verlauf dieses Projektes wurde untersucht, ob DIRs auch an der Bildung von (+)- und (-)-Gossypol beteiligt sind. Dieser Inhaltsstoff der Baumwolle entsteht durch atropselektive Kupplung zweier Hemigossypolradikale. Es wurden zwei DIRs aus Hochlandbaumwolle (Gossypium hirsutum) und ein DIR aus Pima-Baumwolle (G. barbadense) charakterisiert, die alle die Bildung von (+)-Gossypol vermitteln. Wie zuvor beschriebene DIRs verfügen auch die DIRs der Baumwolle über keine eigene oxidative Aktivität und sind daher auf die Bereitstellung der radikalischen Substratmoleküle durch oxidierende Enzyme (hier eine Laccase) angewiesen. Im Weiteren wurde ein Fed-Batch Fermentationsprozess etabliert, der es erlaubt, zwei DIRs der Baumwolle (GbDIR2 und GhDIR3) in guten Ausbeuten und nahezu homogener Form zu gewinnen. Dies gelang durch Einsatz eines genetisch veränderten Pichia pastoris Stammes, der anders als der Wildtypstamm nicht zur Hyperglycosylierung neigt. Die Glycan-Reste wurden massenspektrometrisch charakterisiert, wobei Glycane mit 5 Mannose-Einheiten mit mehr als 90% aller Glycanmodifizierungen deutlich dominierten. Die Glycane erwiesen sich als nicht essentiell für die Funktion der DIRs. Letztlich gelang es im Rahmen dieses Projektes ein (-)-Pinoresinol-bildendendes DIR, nämlich AtDIR6, zu kristallisieren und seine Struktur aufzuklären. Es zeigte sich, dass dieses DIR entgegen früheren Annahmen über zwei Substratbindetaschen je Untereinheit verfügt, die die aromatischen Ringe der beiden Substratradikale aufnehmen. Dabei werden die Propionylseitenketten der Substrate in einer Weise positioniert, die zu einer regio- (C8-C8‘) und enantioselektiven (re,re) Kupplung führt. Darüber hinaus zeigte die Struktur, dass AtDIR6 auch eine aktive katalytische Rolle bei der Zyklisierung des bei der Kupplung entstehenden bis-Chinon-Intermediates übernimmt. Mit der Identifizierung von DIRs in der Gossypol-Biosynthese und der strukturellen Charakterisierung von AtDIR6 hat dieses Projekt erheblich zu einem besseren Verständnis der Bedeutung und Wirkungsweise dieser interessanten Enzymklasse beigetragen.

Publications

• (2015): Dirigent proteins from cotton (Gossypium sp.) for the atropselective synthesis of gossypol. Angew. Chem. Int. Ed. 54: 14660–14663
  Effenberger, I., Zhang, B., Li, L., Wang, Q., Liu, Y., Klaiber, I., Pfannstiel, J., Wang, Q., Schaller, A.
  
• (2015): Dirigentproteine der Baumwolle (Gossypium sp.) für die atroposelektive Synthese von Gossypol. Angew. Chem. 127: 14870–14874
  Effenberger, I., Zhang, B., Li, L., Wang, Q., Liu, Y., Klaiber, I., Pfannstiel, J., Wang, Q., Schaller, A.
  
• (2016): Dirigent protein mode of action revealed by the crystal structure of AtDIR6. Plant Physiol. 172: 2165–2175
  Gasper, R., Effenberger, I., Kolesinski, P., Terlecka, B., Hofmann, E., Schaller, A.
  
• (2017): Expression in Pichia pastoris and characterization of two novel dirigent proteins for atropselective formation of gossypol. Appl. Microbiol. Biotechnol. 101: 2021–2032
  Effenberger, I., Harport, M., Pfannstiel, J., Klaiber, I., Schaller, A.