Koppelung von katalytischem Mechanismus und konformationeller Dynamik in (beta/alpha)8-Fass Enzymen
Biophysik
Strukturbiologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Enzyme katalysieren Reaktionen mit bemerkenswerter Effizienz, Selektivität und Spezifität, und ihre Funktion ist eng gekoppelt an molekulare Bewegungen. In diesem Sinne, schließt der Prozess der Katalyse typischerweise Bewegungen von Aminosäuren im Zuge der Substratbindung und Produktfreisetzung ein. Diese Schritte umfassen Bewegungen einzelner Reste sowie die Öffnung bzw. das Schließen von beweglichen Proteinregionen oder ganzer Proteindomänen. Derartige Liganden-induzierte Konformationsänderungen sind gut dokumentiert und werden unter dem Überbegriff „induced fit“ zusammengefasst. Darunter versteht man, dass die Substratbindung zum Übergang von einer unproduktiven und oftmals schlecht definierten Konformation des aktiven Zentrums zu einer einzigen gut definierten Konformation führt, die komplementär zum Übergangszustand der Reaktion ist. Nichtsdestoweniger wird die direkte Beteiligung von Enzymbewegungen an der Katalyse kontrovers diskutiert. Wir haben diese Frage am Beispiel der mobilen β1α1-Schleife (Schleife1) des (βα)8-Fass Enzyms HisF studiert, welches die Cyclase-Untereinheit der Imidazolglycerinphosphat (ImGP) Synthase darstellt. Varianten von Schleife 1 mit Einzelmutationen konservierter Aminosäuren zeigten eine drastische Verringerung der Umsatzrate für die Substrate N´-[(5´-phosphoribulosyl) formimino]-5-aminoimidazole-4-carboxamid-ribonucleotid (PrFAR) and Ammoniak in die Produkte ImGP und 5-aminoimidazol-4-carboxamid-ribotid (AICAR). Eine umfassende mechanistische Analyse, welche stopped-flow Kinetiken, Röntgenkristallographie, NMR-Spektroskopie und MD-Simulationen beinhaltete, führte zur Identifizierung von drei Konformationen von Schleife 1 (offen, freistehend, geschlossen), deren relativer Anteil sich zwischen wildtypischem HisF und funktionell beeinträchtigten Varianten unterschied. Stopped-flow Experimente zeigten, dass wildtypisches HisF das Substrat PrFAR mittels eines zwei-stufigen „induced fit“ Mechanismus bindet, während Varianten mit beeinträchtigter Katalyse dies mit einem einfachen Zweizustandsmechanismus tun. Unsere Ergebnisse lassen vermuten, dass die PrFAR-induzierte Bildung der geschlossenen Konformation von Schleife 1 an der Katalyse beteiligte Reste in eine produktive Orientierung für den chemischen Umsatz bringt, welcher den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Reaktion darstellt. Nach Abschluss der Cyclase-Reaktion, wird die geschlossene Konformation destablisiert, was die Bildung der freistehenden und der offenen Konformationen begünstigt und so die Freisetzung der Produkte ImGP und AICAR erlaubt. Unsere Daten zeigen, wie unterschiedliche Konformationen einer am aktiven Zentrum gelegenen Schleife unterschiedliche katalytische Schritte ermöglichen und sind somit von allgemeiner Bedeutung für (βα)8-Fass Enzyme und darüber hinaus.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
-
Conformational Modulation of a Mobile Loop Controls Catalysis in the (βα) 8 -Barrel Enzyme of Histidine Biosynthesis HisF. JACS Au, 4(8), 3258-3276.
Hupfeld, Enrico; Schlee, Sandra; Wurm, Jan Philip; Rajendran, Chitra; Yehorova, Dariia; Vos, Eva; Ravindra, Raju Dinesh; Kamerlin, Shina Caroline Lynn; Sprangers, Remco & Sterner, Reinhard
