Dynamisches Verhalten der Enhancer Aktivität und der Genexpression nach der zygotischen Genomaktivierung im Zebrafisch

• Antragstellerin: Dr. Daria Onichtchouk
• Fachliche Zuordnung: Entwicklungsbiologie ; Evolutionäre Zell- und Entwicklungsbiologie der Tiere
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 274453961

Die Forschung an zeitlich unbegrenzt pluripotenten in-vitro ES und EpiS Zellkulturen, die aus Säugetier-Embryonen im frühen Stadium isoliert werden können, hat die zentrale Rolle der Transkriptionsfaktoren Pou5f1/Oct4, SoxB1 und Nanog in der genetischen Kontrolle des pluripotenten Zustandes etabliert. Wir und andere haben gezeigt, dass die Zebrafisch Homologe von "Pluripotenz Transkriptionsfaktoren" (Pluripotenz-TFs) Pou5f3, SoxB1 und Nanog eine zentrale Rolle auch in der Zygotischen Genaktivierung (ZGA) spielen. Die mechanistische Verbindung zwischen dem Chromatin Status, der Transkriptionsfaktoren-Bindung und der Genexpression ist nicht vollständig geklärt. Um diese grundlegenden Fragen zu lösen, bietet das Modelsystem Zebrafisch einzigartige experimentelle Möglichkeiten durch das Kombinieren von Mutanten-Analyse mit funktionaler Genomik. Während der letzten drei Jahre haben wir die Mutanten-Linien für Nanog und SoxB1 etabliert, sowie die Doppelmutanten-Linien Pou5f3/SoxB1, Pou5f3/Nanog und SoxB1/Nanog. Alle maternal-zygotischen Einzel- und Doppelmutanten überleben die ersten drei Stunden nach der zygotischen Genomaktivierung. Dies ermöglicht es, die Dynamik der Genexpression zu untersuchen und mit der zeit- und Genotyp-abhängigen Änderung der Zugänglichkeit von Enhancern in Verbindung zu bringen. Um Rückschlüsse auf die Dynamik der Netzwerke zu ziehen, die die Genexpression kontrollieren, ist es entscheidend, die Information von der Gentranskription und des Chromatin Status zu unterschiedlichen Zeitpunkten für jede Gen-regulierende Region zu erhalten. Zu diesem Zweck werden RNA- und ATAC-Sequenzierungsdaten von den Einzel- und Doppelmutanten in Abhängigkeit der Zeit generiert und analysiert. Des Weiteren wird untersucht, ob die Bindung der Pluripotenz TF an ihre Motive im Genom gegenseitig gefördert oder behindert wird. Hierfür werden wir ChIP-Seq Analysen für die jeweils anderen beiden Transkriptionsfaktoren in den Mutanten Embryonen durchführen. Die so generierten Daten werden anschließend für die Erstellung von Regulationsmodellen für alle zygotischen Gene, die vor dem embryonalen Gastrulations-Stadium exprimiert werden, verwendet. Im Weiteren wollen wir Transplantations-Assays anwenden, um das Potenzial zur Differenzierung der Doppelmutanten-Zellen zu charakterisieren. Wir haben gezeigt, dass post-ZGA Zellen aus Zebrafisch große Ähnlichkeiten zu Säuger ES Zellen aufweisen, in Bezug auf ihre Chromatin-“Landschaft”, hohe Transkriptionsaktivität, und auch in der bekannten Liste der in ihnen exprimierten Gene. Wir erwarten daher, dass die Ergebnisse unserer Experimente generelle Ordnungsprinzipien des Pluripotenz-Zustandes und des ihm zugrunde liegenden genregulatorische Netzwerke (GRNs) aufklären werden. Darüber hinaus sollte dieses Wissen das Designen von neue Strategien zur Zellumprogrammierung ermöglichen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen