Untersuchung der Aktivität des SMC Chromosomen-Kondensationskomplex auf Einzelmolekül-Ebene

• Antragsteller: Professor Dr. Peter Graumann
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 274661393

SMC (structural maintenance of chromosomes) Proteine üben zentrale Funktionen in verschiedenen dynamischen Chromosomen Prozessen aus, in allen drei Domänen der Lebewesen. SMCs sind ATPasen und bilden das Zentrum unterschiedlicher Komplexe, welche in Eukaryonten essentiell für Chromosomen Kohäsion und Kompaktierung sind, sowie in Bakterien für Chromosomen Segregation. Der Verlust von SMC oder seiner Komplexpartner (ScpA und ScpB in Bakterien) führt zu einem Block in der Mitose, und zu zum Defekt in der Kompaktierung und Segregation von Chromosomen in Bakterien. SMC Proteine sind also zentrale Elemente des Zellzyklus. Wir haben kürzlich gezeigt, dass SMC im Modell-Bakterium Bacillus subtilis in zwei unterschiedliche Fraktionen in Zellen existiert: freies SMC (nicht an ScpA und ScpB gebunden, die einen engen Subkomplex ausbilden) wandert durch das gesamte Chromosom, während 20% alles Moleküle statisch lokalisieren, und an ScpAB gebunden so genannte Kondensationszentren ausbilden, je einen pro Zellhälfte. Diese Strukturen sind essentiell für die Chromosomen Segregation, und werden aufgelöst, wenn entweder SMC, ScpA oder ScpB depletiert werden. ScpA und ScpB sind hauptsächlich statisch in den Zentren vorhanden, nur etwa 15% der Moleküle diffundieren frei durch die Zelle. Ungewöhnlich ist der schnellere Austausch von SMC als von ScpA in den Zentren, die Untereinheiten weisen unterschiedliche Wechselkinetiken auf. SMC besitzt also eine neuartige Art der Interaktion mit Chromosomen: eine statische, ScpAB gebundene Fraktion, die nicht an DNA binden kann, und eine mobile Fraktion, die in vitro an DNA binden kann. Wir werden die Visualisierung und automatisierte Verfolgung einzelner SMC Moleküle und neue biochemische Untersuchungsmethoden einsetzten, um die Funktionsweise von SMC auf molekularer Ebene zu analysieren. Wir werden untersuchen, wie die Kondensationszentren ausgebildet werden, für welche Prozesse der ATPase Zyklus von SMC notwendig ist, und wie SMC mit DNA auf Einzelmolekül-Ebene interagiert. Die Bewegung von ATP Bindungs - und ATPase Mutanten von SMC und vieler weiterer Konstrukte wird durch Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie untersucht, in B. subtilis Zellen, sowie die Bedingungen für die Rekrutierung von ScpA und ScpB in die Kondensationszentren. Alle Experimente werden durch die Untersuchung der Kinetik der Komplexbildung (durch Thermophorese und ITC), zum Verständnis der ungewöhnlichen Austauschraten in den Zellen, und durch die Untersuchung der DNA Bindung in vitro komplementiert. Wir werden weiterhin durch CHIP Experimente untersuchen, ob die statischen ScpA Moleküle mit bestimmten Regionen auf dem Chromosom assoziiert sind, oder ob die Strukturen mit vielen Bereichen auf dem Chromosom interagieren. Die Visualisierung von SMC auf Einzelmolekülebene in lebenden Zellen wird auch für das generelle Prinzip der Interaktion von SMC Proteinen mit Chromosomen in eukaryontischen Zellen informativ sein.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen