Identifizierung spezifischer Zielgene des wachstumsfördernden transkriptionellen Regulators Yorkie in neuralen Stammzellen von Drosophila melanogaster
Entwicklungsbiologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ausgangsfragestellung der geförderten Projekte war es, die neuralen Stammzellspezifischen Zielgene des transkriptionellen Regulators Yorkie zu identifizieren. Hierzu sollten CHIP-Analysen an FACS-gesorteten neuralen Stammzellen durchgeführt werden. Erste Ergebnisse zeigten, dass, ähnlich zur Flügelimaginalscheibe, Tgi in einem Komplex mit Scalloped vorliegt, um Yki Zielgene zu reprimieren. Wir konnten bantam Bindestellen in der tgi mRNA nachweisen und erste Luciferaseassay zeigten, dass bantam tgi negativ reguliert. Hieraus konnten wir schließen, dass Yki über die bantam micro-RNA den Yki-Zielgen Repressor Tgi herunter reguliert. Diese Experimente müssten allerdings noch bestätigt werden. Im zweiten Teil erarbeiteten wir in Zusammenarbeit mit unserem Postdoc Dr. Junaid Akthar ein Protokoll zur Etablierung von ChIP-Sequenzierung mit ultrageringem Ausgangsmaterial (z.B: 1000 NSCs von Drosophila). Diese Methode nennen wir TAF ChIP, da wir die hyperaktive Tn5 Transposase zur Fragmentierung der immunpräzipitierten DNA benutzen. Dies macht das Protokoll sehr einfach und robust und es geht wenig Material verloren. Ein Vergleich mit konventionellen ChIP-Sequenzierungen zeigt die Ebenbürtigkeit unsere Methode. Im letzten Förderungsabschnitt arbeiteten wir an der Beschreibung epigenetischer Faktoren und Ihren Einfluss auf die Entwicklung der Typ II NSCs in Drosophila. Wir konnten zeigen, dass der Enok HAT Komplex (Enok, Br140, ING5 und EAF6) die Stammzellidentität der Typ II NSCs aufrechterhält. Verlust von Enok oder Br140 führt zur Transformation der NSCs in Typ I NSCs. ChIP-Analysen zeigten, dass dies über die von Enok-positiv regulierten Gene btd und pnt vermittelt wird. Expression von pnt im enok-knockdown Hintergrund rettet den Transformationsphänotyp.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2019) TAF-ChIP: an ultra-low input approach for genome-wide chromatin immunoprecipitation assay. Life science alliance 2 (4) 1-12
Akhtar, Junaid; More, Piyush; Albrecht, Steffen; Marini, Federico; Kaiser, Waldemar; Kulkarni, Apurva; Wojnowski, Leszek; Fontaine, Jean-Fred; Andrade-Navarro, Miguel A.; Silies, Marion; Berger, Christian
(Siehe online unter https://doi.org/10.26508/lsa.201900318)
