Funktionelle genomische Analyse der leukämischen Evolution bei Kindern mit Down Syndrom durch CRISPR-Cas Genomeditierung
Hämatologie, Onkologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Transformationsmechanismen von Vorläuferläsionen zu vollständig transformierten Krebsarten bleiben unvollständig verstanden. Da groß angelegte Sequenzierungsstudien die genetische Landschaft von Vorläuferläsionen und vollständig transformiertem Krebs offenbarten, ist es jetzt von entscheidender Bedeutung, genetische Varianten während der Krebsentstehung und -transformation funktional zu kommentieren. Leukämie im Kindesalter ist ein hervorragendes Modell, um mit der Durchführung dieser Funktionsstudien zu beginnen, da zeitlich unterschiedliche präleukämische (Vorläufer-) Zustände vorliegen, die die separate Untersuchung von Präleukämie und Leukämie ermöglichen. Wir haben die myeloische Präleukämie bei Neugeborenen mit Down-Syndrom (bekannt als transiente abnormale Myelopoese oder TAM) und die klonal abgeleitete myeloische Leukämie bei Down-Syndrom (auch bekannt als ML-DS) seit vielen Jahren untersucht. Bemerkenswerterweise entwickeln ~ 30% aller Neugeborenen mit Down-Syndrom eine TAM. Bis zu unserer Arbeit war nicht bekannt, ob in einigen oder allen Fällen von TAM zusätzliche Mutationen erforderlich sind. ~ 20% der Säuglinge mit TAM bekommen eine ML-DS, und dies ist typischerweise mit dem Erwerb zusätzlicher genetischer Veränderungen in wiederkehrend mutierten Genen verbunden, beispielsweise solchen, die Signalmoleküle und epigenetische Regulatoren codieren. In unserer Arbeit stellen wir neuartige Daten mit Implikationen von allgemeinem Interesse für die Krebsforschung bereit. Zunächst haben wir die größte Sequenzierungsstudie mit TAM- und ML-DS- Patientenproben von drei kooperativen Leukämiegruppen (in Großbritannien, der deutschen BFM- Gruppe und der US-Childhood-Oncology-Group) analysiert. Weiter verwendeten wir unseren umfangreichen genetischen Datensatz als Plattform, um entsprechend zielgerichtete, umfassende Funktionsstudien durchzuführen, einschließlich eines Multiplex-CRISPR-Cas9-Genomeditierungs Screenings, um die Bedeutung der von uns identifizierten Varianten zu verstehen. Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass ML-DS normalerweise mit dem Erwerb zusätzlicher Varianten neben einer GATA1-Mutation verbunden ist. Wichtig ist, dass wir im CSF2RB-Gen, welches für die gemeinsame Beta-Kette der IL-3-, IL-5- und GM-CSF-Rezeptoren kodiert, eine zuvor nicht beschriebene Variante (A455D) mit Funktionsgewinn identifiziert haben. In weitgefächerten funktionellen Studien zeigten wir, dass diese Variante onkogen ist, die Zellproliferation fördert, Signale über STAT5 und nicht über PI3-Kinase sendet, die Proliferation primärer menschlicher CD34+-Zellen fördert und gleichzeitig die Megakaryozyten-Differenzierung verzögert. Darüber hinaus haben wir einen therapeutischen Ansatzpunkt identifiziert: JAK-Kinase Inhibiton durch Ruxolitnib ist sehr effektiv gegen mutierte Zellen. Wir haben ein neuartiges Mausmodell von TAM weiterentwickelt, mit dem wir ein Multiplex- CRISPR-Cas9-In-vivo-Screening von loss-of-function Mutationen in den in unserem Datensatz identifizierten epigenetischen Regulatoren, Cohesin, CTCF und TP53 durchführen konnten. Im selben Screening testeten wir auch die Bedeutung der ML-DS-assoziierten Verstärkung von Funktionsmutationen in Signalwegen, indem wir auf deren negative Regulatoren abzielten. Diese Experimente bestätigten, dass diese Gene "TAM" transformieren und zu einer Megakaryozyten- Erythroid-Leukämie mit hoher Penetranz führen, die ML-DS, aber nicht andere pädiatrische Leukämien, transkriptionell widerspiegelt, wenn sie durch RNA-Sequenzierung analysiert werden. Insgesamt ist dies wohl die umfangreichste und vollständigste genetische Charaktisierung einer Krebsart. Unseres Wissens nach gibt es keine Studie, die eine so große Kohorte genetisch charakterisiert hat und danach die gefundenen Mutation auf ihr onkogenes Potential in einem geeigneten Mausmodell untersucht hat. Unsere Ergebnisse zeigen aber, dass dies von besonderer Bedeutung ist.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Refined sgRNA efficacy prediction improves large- and small-scale CRISPR-Cas9 applications. Nucleic Acids Res. 2017 Dec 18
Labuhn M, Adams FF, Ng M, Knoess S, Schambach A, Charpentier EM, Schwarzer A, Mateo JL, Klusmann JH, Heckl D
(Siehe online unter https://doi.org/10.1093/nar/gkx1268) - GATA1s exerts developmental stage-specific effects in human hematopoiesis. Haematologica. 2018 Aug;103(8):e336-e340
Gialesaki S, Mahnken AK, Schmid L, Labuhn M, Bhayadia R, Heckl D, Klusmann JH
(Siehe online unter https://doi.org/10.3324/haematol.2018.191338) - Pooled Generation of Lentiviral Tetracycline-Regulated microRNA Embedded Short Hairpin RNA Libraries. Hum Gene Ther Methods. 2018 Jan 12
Adams FF, Hoffmann T, Zuber J, Heckl D, Schambach A, Schwarzer A
(Siehe online unter https://doi.org/10.1089/hgtb.2017.182) - Mechanisms Of Progression Of Myeloid Preleukemia To Transformed Myeloid Leukemia In Children With Down Syndrome. Cancer Cell 2019
Labuhn M, Perkins K, Matzk S,Varghese L, Garnett C, Papaemmanuil E, Metzner M, Kennedy A, Amstislavskiy V, Risch T, Bhayadia R, Samulowski D, Hernandez DC, Stoilova B, Iotchkova V, Scheer C, Yoshida K, Schwarzer A, Taub J, Crispino JD, Weiss MJ, Hayashi A, Taga T, Ito E, Ogawa S, Reinhardt D, Yaspo ML, Campbell PJ, Roberts I, Constantinescu S, Vyas P , Heckl D , Klusmann JH
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.ccell.2019.06.007)
