Untersuchung der molekularen Prinzipien der UPF1-abhaengigen mRNA Substraterkennung und -abbau

• Antragsteller: Professor Dr. Niels H. Gehring; Professor Dr. Markus Landthaler
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 276820253

In allen Organismen ist die Genexpression ein fundamentaler Prozess, der eine aufwendige Qualitätskontrolle benötigt, um die Synthese von fehlerhaften RNAs oder Proteinen zu begrenzen. Die Beseitigung von abnormalen Transkripten dient dazu den Organismus vor möglicherweise schädlichen Effekten von fehlerhaften Proteinprodukten zu schützen, die möglicherweise die normale Funktion von Zellen oder ihrer molekularen Maschinen beeinträchtigen. Ein bekannter und gut untersuchter Abbauweg und zellulärer Kontrollmechanismus wird als Nonsens-vermittelter mRNA Abau (NMD) bezeichnet. Dieser zerstört Transkripte mit vorzeitigen Translationscodons (PTC). NMD kommt in allen eukaryontischen Organismen vor und ein konservierter Satz von Faktoren dient dazu solche mRNAs zu entfernen, die nicht an einer vorgesehenen Position die Translation beenden. Das zentrale Protein des NMD, die RNA-Helikase UPF1, spielt eine wichtige Rolle während der Erkennungs- und Abbauphasen des NMD. UPF1 wird durch seine Interaktion mit dem eukaryontischen Terminationsfaktor eRF3 an die Substrat-RNA gebracht und daraufhin durch seine Kinase SMG1 phosphoryliert. Bestimmte phosphorylierte Reste von UPF1 dienen als Bindungsstellen für die Abbaufaktoren SMG5/7 und SMG6. Diese leiten den Abbau durch Deadenylierung und Entfernen der Kappe (SMG5/7) beziehungsweise durch endonukleolytische Spaltung (SMG6) ein. Obwohl UPF1 als Schlüsselkomponente des NMD und molekulare Verbindung zwischen der Translation und dem mRNA Abbau gilt, wissen wir noch wenig über die molekulare Funktion von UPF1 während der verschiedenen Phasen des NMD. Daher möchten wir im Rahmen dieses Antrags die Bindungsstellen von UPF1 auf NMD Substraten identifizieren und mit verschiedenen NMD-spezifischen Eigenschaften dieser Substrat-mRNAs korrelieren. Diese NMD-spezifischen Eigenschaften sind die Positionen, an denen die mRNA gespalten wird, oder verstärkte Signale von Ribosomen an Terminationskodons. Wir wollen mittels CLIP die Positionen von UPF1 und Mutanten sowohl auf Reporter-mRNAs und zellulaeren mRNAs bestimmen. Weiterhin beabsichtigen wir diese Positionen den Stellen endonukleolytischer Spaltung durch SMG6 zuordnen, die wir mittels eine modifizierten Form von 5 Sequenzierung erkennen werden. Wir erwarten, dass wir mit Hilfe dieser Daten einen Einblick in den Mechanismus des NMD erhalten und molekulare Prinzipien der UPF1-abhängigen Erkennung und Eliminierung von NMD Substraten enthüllen. Durch die Kombination der biochemischen Eigenschaften von UPF1 mit den entsprechenden Effekten auf mRNA Bindung und mRNP Zusammenstellung können wir die molekularen Funktionen des zentralen NMD-Faktors UPF1 verstehen. In Untersuchungen mit Reportergenen werden wir schließlich unsere Erkenntnisse in einem definierten System testen. Unser endgültiges Ziel ist es, ein Modell des NMD zu entwickeln das sowohl die bekannten Eigenschaften des NMD beinhaltet, als auch korrekte Vorhersagen über das Verhalten von NMD Substraten macht.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen