Detailseite
Projekt
Präzise Identifizierung von m6A in mRNA bei der Zebrafischentwicklung
Antragstellerinnen / Antragsteller
Professor Dr. Sebastian Leidel; Professorin Dr. Andrea Rentmeister
Fachliche Zuordnung
Biochemie
Förderung
Förderung von 2015 bis 2019
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 277312457
Die reversible Methylierung von mRNA an der N6-Position von Adenosin (m6A) ist die häufigste interne mRNA-Modifikation in höheren Eukaryoten. Untersuchungen an verschiedenen Organismen zeigen, dass diese Modifikation für die Entwicklung von Keimbahnzellen und die Embryogenese von außerordentlicher Bedeutung ist. Die genaue Funktion von m6A während der Ontogenese wird allerdings nach wie vor nur unzureichend verstanden. Für ein besseres Verständnis der Funktion von m6A ist es von entscheidender Bedeutung, ein detailliertes und quantitatives Bild dieser Modifikationen in verschiedenen Zelltypen und Entwicklungsstadien zu erhalten. Hierfür ist die präzise und direkte Identifizierung von Modifikationsstellen erforderlich. Obwohl m6A-Stellen mit Hilfe von m6A-spezifischen Antikörpern in Kombination mit Photo-Quervernetzung bereits Transkriptom-weit kartiert werden können, mangelt es diesen Methoden noch an Präzision, und sie erfordern besonders tiefes Sequenzieren. Die direkte Quantifizierung von m6A ist möglich, aber nicht in Transkriptom-weiten Analysen anwendbar. Um diese methodischen Schwierigkeiten zu überwinden, haben wir einen neuartigen chemisch-biologischen Ansatz entwickelt, der es ermöglicht, m6A-Stellen direkt und präzise zu kartieren. Hierfür nutzen wir synthetische Analoga des Kosubstrats S-Adenosyl-L-methionin (AdoMet), die von METTL3-METTL14 umgesetzt werden und dadurch nicht-natürliche Modifikationen an RNA anbringen. Wir haben gezeigt, dass sich nicht-natürliche Modifizierungen in Kombination mit Klick-Chemie gezielt nutzen lassen, um die reverse Transkription zu blockieren. Die resultierenden RNA-Proben können verwendet werden, um Sequenzierbibliotheken zu generieren, die eine genaue Zuordnung der m6A-Stellen ermöglichen. Die vergleichende Analyse verschiedener Bibliotheken ermöglicht es, Transkriptom-weit eine relative Quantifizierung des Grads der N6-A-Modifizierung vorzunehmen.Auf Grundlage dieser Ergebnisse wenden wir unseren Ansatz nun in Säugerzellen und Zebrafisch an, um die Rolle von METTL3 in der Methylierung von mRNA zu untersuchen. Darüber hinaus werden wir die Dynamik zellulärer Methylierungsreaktionen unter Stress untersuchen, indem wir Puls-Labeling durch nicht-natürliche Modifizierungen durchführen. Ein integrierter Vergleich von Sequenzierbibliotheken wird uns in die Lage versetzen, m6A-Stellen im Transkriptom-Maßstab relativ zueinander zu quantifizieren.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
Internationaler Bezug
Schweiz
