Ein integrierter Ansatz zur Analyse von Struktur, Funktion und Dynamik von TRAP Transportern

• Antragsteller: Privatdozent Dr. Gregor Hagelueken
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biophysik
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 277679584

Die TRAP Transporter (tripartite ATP-independent periplasmic transporters) sind eine wichtige und weit verbreitete Klasse von Transportern in Bakterien und Archaeen. TRAPs bestehen typischerweise aus zwei Transmembrandomänen und einem löslichen Substrat-Bindungsprotein (SBP). Die einzelnen Mitglieder translozieren eine Vielfalt von Substraten, einschließlich C4-Dicarboxylate, Aminosäuren oder Sialinsäure. Das letztere Molekül spielt eine wichtige Rolle bei Infektionsprozessen von pathogenen Bakterien, wie Vibrio cholerae oder Haemophilus influenzae. Aus diesem Grund, und weil TRAP-Transporter nicht in Eukaryonten vorkommen, stellen sie ein interessantes Ziel für die Arzneimittelentwicklung dar. Im Gegensatz zu anderen Transporter-Klassen (z. B. ABC-Transporter oder sekundär aktive Transporter) ist relativ wenig über TRAP Transporter bekannt, vor allem von einem strukturellen Standpunkt aus betrachtet. Dieser Antrag beschreibt deshalb einen integrierten Ansatz aus PELDOR Spektroskopie, Röntgenkristallographie und Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie, um die Struktur, Funktion und Dynamik der TRAP-Transporter zu untersuchen. Der Transportmechanismus der TRAP Transporter soll mittels PELDOR Spektroskopie untersucht werden. Die aktuelle Arbeitshypothese für den Transportzyklus von TRAP Transportern umfasst mehrere Konformationsänderungen, welche durch Substrat-Translokation oder Wechselwirkungen zwischen Transporter und dem SBP ausgelöst werden. Diese Konformationsänderungen sollen durch PELDOR Messungen der Spin-markierten Proteine analysiert werden. Zur gleichen Zeit wird der gereinigte Transporter/SBP Komplex kristallisiert und mittels Röntgenkristallographie untersucht, um hochaufgelöste Informationen zu sammeln. Die für PELDOR erstellen Cystein-Mutanten können für Einzelpartikel-Fluoreszenzmikroskopie Experimente wiederverwendet werden. Zu diesem Zweck werden Fluoreszenz-Marker an Transporter und SBP angebracht und der Transporter in GUVs (giant unilamellar vesicles) rekonstituiert. Die Interaktion zwischen Transporter und SBP soll dann mittels Einzelpartikel-Verfolgungs- und Kolokalisations-Experimenten unter verschiedenen Bedingungen analysiert werden. Die kombinierten Ergebnisse aus allen drei Methoden werden ein sehr detailliertes Bild der TRAP-Transporter zu liefern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen