Neue Fluorophore und Labelingstrategien für Einzelmolekül-Spektroskopie

• Antragsteller: Dr. Maximilian Ulbrich
• Fachliche Zuordnung: Biophysik
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 278267951

Wechselwirkungen zwischen Proteinen sind die Grundlage der meisten biologischen Vorgänge in Zellen. Viele der üblichen biochemischen Methoden zielen darauf ab, die Wechselwirkung zwischen jeweils zwei Proteinen zu finden, aber scheitern bei der Anwendung auf komplexe Interaktionsmuster mit drei oder mehr Proteinen und bei der Bestimmung der Anzahl einzelner Moleküle im Komplex. Membranproteine sind dabei eine besondere Herausforderung, weil sie niedrige Expression aufweisen oder zum Zusammenklumpen neigen können, wenn sie aus der Membranumgebung herausgelöst werden.Wir haben eine Einzelmolekülmethode entwickelt, mit der sich Untereinheiten von Membranprotein-Komplexen zählen und direkte Wechselwirkungen von Proteinen in der Membran einer lebenden Zelle untersuchen lassen. Die Methode basiert auf der Beobachtung von Ausbleich-Schritten von fluoreszierenden Proteinen (FPs), die genetisch an das Zielprotein fusioniert werden, und auf Kolokalisation von FPs unterschiedlicher Emissionswellenlänge. Für komplexere Interaktionsmuster fehlt eine dritte oder vierte Farbe, und für die Beobachtung schnell diffundierender Membranproteine sind die momentan verfügbaren roten FPs nicht hell genug.Das Ziel des beantragten Projekts ist es, die Anzahl der gleichzeitig verwendbaren Fluoreszenzmarker auf drei oder vier zu erweitern, und neue Strategien einzuführen, um Membranproteine in lebenden Zellen mit organischen Farbstoffen zu markieren. Wir werden für die FPs und organischen Farbstoffe die photophysikalischen Eigenschaften bestimmen, die für Einzelmolekül-Beobachtungen relevant sind, z.B. der Anteil nichtfluoreszenter Moleküle, das Blinkverhalten und die Photostabilität unter den Beleuchtungsverhältnissen für Einzelmolekülexperimente. Die geplanten Strategien für die Markierung mit organischen Farbstoffen beinhalten SNAP-tag, HALO-tag und Nanobody-Labeling. Bereits etablierte multimere Membranproteine und genetisch fusionierte Ketten aus FPs werden als Gerüst dienen, um die Farbstoffe im Kontext der lebenden Zelle zu immobilisieren.Einerseits soll die vorgeschlagene Arbeit uns bei laufenden Studien an Membranproteinen helfen, und wird andererseits auch eine wichtige Hilfe für andere Wissenschaftler sein, die Einzelmolekül-Untersuchungen von Protein-Interaktionen mit Hilfe von FPs durchführen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen