Nukleinsäurespezifische, photoschaltbare Fluorophore für die Detektion von RNAs in lebenden Zellen

• Antragsteller: Professor Dr. Andriy Mokhir
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 278738575

Photochemische, nukleinsäureabhängige (Templat-vermittelte) Reaktionen finden potentiell Anwendung in der biologischen Forschung um endogene Ribonukleinsäuren in lebenden Zellen zeitlich und räumlich aufgelöst zu untersuchen. Beispielsweise wurde die Photoreduktion von Arylazid-basierten spaltbaren Linkern in Anwesenheit von Ru(II)-Bipyridin-Komplexen unter Bestrahlung mit Licht einer Wellenlänge von 455 nm genutzt um miR-21 in BT474 Zellen nachzuweisen. Einige weitere Templat-vermittelte Reaktionen wurden beschrieben, die durch UV-Licht und kurzwelliges, sichtbares Licht (<532 nm) kontrolliert werden können. Jedoch sind solche Trigger nicht ideal für zelluläre Anwendungen. Insbesondere UV-Licht führt zu DNA-Mutationen und ist zytotoxisch, wohingegen sichtbares Licht (<550 nm) effizient von endogenen Riboflavinen absorbiert wird. Diese gehen in ihren angeregten Triplettzustand über, welcher anschließend in der Zelle gequencht wird. Dabei entstehen Singulett-Sauerstoff, Superoxidanion-Radikal und anderen reaktiven Spezies, die die DNA-Mutationen, den Abbau von Riboflavinen und die Zerstörung anderer Biomoleküle verursachen können. Diese Nebeneffekte limitieren die zelluläre Anwendbarkeit der photochemischen Templat-vermittelten Reaktionen. Zellen sind jedoch praktisch unempfindlich gegenüber Licht mit Wellenlängen größer 650 nm. Deshalb werden Reagenzien, welche auf dieses Licht ansprechen, als kompatibel für Experimente in lebenden Zellen erachtet.Das Ziel dieses Projektes ist die Entwicklung von caged-Fluorophoren, welche durch nicht-toxisches rotes Licht in der Gegenwart von spezifischen Ribonukleinsäuren aktiviert werden sollen. Alle benötigten Komponenten dieses Systems, bestehend aus einem caged-Fluorophor (Substrat) und einem Photokatalysator, sollen an einem RNA-Target durch eine hoch-spezifische Hybridisierungsreaktion zusammengeführt werden. Die Bestrahlung dieses hybridisierten Systems mit rotem Licht führt zur Generierung von Singulett-Sauerstoff an dem Katalysator in räumlicher Nähe zum Substrat. Letzteres wird mit dem Singulett-Sauerstoff reagieren, wodurch ein helles, photostabiles Fluorophor entsteht, welches durch Anregung mit Licht geeigneter Wellenlänge über 1000 Photonen generieren kann. Diese hervorragende Signalverstärkung erlaubt die Detektion eines einzelnen Farbstoffs mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Einzelmolekülfluoreszenz-Imaging. Basierend auf dieser Reaktion soll eine Methode zur Detektion, Lokalisierung und Beobachtung von selten vorkommenden endogenen RNAs (bis hin zu einer einzelnen Sequenz pro Zelle) entwickelt werden. Der Photokatalysator soll soweit optimiert werden, dass er die ausreichende Menge der reaktiven Spezies generiert um das caged-Fluorophor vollständig zu aktivieren. Jedoch soll dieser nach vollendeter Reaktion schnell gebleicht werden, um den möglichen toxischen Effekt des Singulett-Sauerstoffs zu vermeiden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen