Gerichtete Evolution von Cytochrom P450 Enzymen mit nicht-natürlicher Aktivität zur Entwicklung effizienter Biokatalysatoren und Bestimmung der Grundlagen enzymatischer Funktionalität

• Antragsteller: Dr. Oliver Brandenberg
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 278933817

Enzyme katalysieren chemische Reaktionen mit ausgezeichneter Selektivität und Effizienz und unter milden Reaktionsbedingungen. Somit stellen Enzyme ausgezeichnete Werkzeuge für biotechnologische Prozesse und eine umweltschonende Grüne Chemie dar. Allerdings ist das Repertoire nützlicher Enzyme beschränkt und für eine Vielzahl industriell wichtiger chemischer Reaktionen existieren keine passenden Enzyme, wodurch die Möglichkeiten biokatalytischer Produktionsprozesse stark eingeschränkt sind. Gerichtete Evolution von Proteinen ist eine Methode, um nützliche neue Enzyme mit nicht-natürlichen Katalysefunktionen zu erhalten. Diese Methode wurde kürzlich auf Cytochrom P450 Enzyme angewandt und resultierte in einer Reihe neuartiger P450 Enzyme mit nicht-natürlicher katalytischer Aktivität. Diese neuen P450 Enzyme zeigen jedoch eine niedrige katalytische Effizienz und schnelle Enzyminaktivierung, was sie für industrielle Anwendungen ungeeignet macht und des Weiteren die fundamentale Frage aufwirft, wie neuartige, effiziente Enzyme in der Natur entstehen. Aus diesen Gründen schlage ich vor, gerichtete Evolution anzuwenden um Varianten der neuen P450 Enzyme zu erhalten die die gewünschte Reaktion mit hoher Effizienz und Stabilität direkt in einem passenden Wirtsorganismus katalysieren. Ich werde Sammlungen von P450 Enzymmutanten über PCR-basierte Methoden herstellen und diese Sammlungen dann mit einem Screening-Verfahren nach Varianten sichten, die verbesserte katalytische Eigenschaften aufweisen. Iterative Runden von P450 Mutagenese und Screening werden angewendet werden, mit dem Ziel P450 Varianten zu erhalten die nicht-natürliche Reaktionen mit hoher Effizienz und Stabilität in vivo katalysieren. In einem zweiten Schritt werde ich diese verbesserten P450 Varianten einer detaillierten biochemischen und strukturellen Analyse unterziehen um die molekularen Faktoren zu bestimmen, die für hohe katalytische Aktivität in vivo ausschlaggebend sind. Die hier vorgeschlagene Forschung hat somit eine doppelte Zielsetzung: Zum einen werden neuartige Cytochrom P450 Enzyme generiert, die nicht-natürliche Reaktionen mit hoher Effizienz katalysieren und somit attraktive Bausteine für biokatalytische Produktionsprozesse darstellen. Zweitens werden Einblicke in die molekularen Grundlagen und Struktur-Funktions-Interaktionen ermöglicht, die für hohe enzymatische Aktivität in vivo verantwortlich sind. Diese Einblicke in die evolutionären Routen, die von einem ineffizienten Enzym zu einer Variante mit hoher katalytischer Aktivität führen, sind von Relevanz für die zielgerichtete Entwicklung anderer Protein- und Enzymfamilien. Somit wird die vorgeschlagene Forschung das Feld der Biokatalyse vorantreiben und einen Beitrag zur Etablierung nachhaltiger chemischer Produktionsprozesse leisten.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeberin: Professorin Frances H. Arnold, Ph.D.