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Projekt
Eigenschaften und Funktionen von Kalzium-bindenden Proteinen (CaBPs) bei der synaptischen Schallkodierung
Antragstellerin
Professorin Dr. Tina Pangrsic Vilfan
Fachliche Zuordnung
Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen
Förderung
Förderung von 2015 bis 2019
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 279586126
Spannungsabhängige CaV1.3 (L-Typ) Kalziumkanäle steuern den präsynaptischen Kalziumeinstrom und die Exocytose an Bändersynapsen der inneren Haarzellen des Innenohres und sind für das Hören essentiell. Diese Kanäle werden von Kalziumionen, die durch sie einströmen, reguliert, und diese Regulation wird von Calmodulin gesteuert. Hierbei wirken Kalzium-bindende Proteine (CaBPs) Calmodulin entgegen, indem sie für Bindungsstellen am Kanal kompetitieren. Sowohl Calmodulin als auch CaBPs gehören in die Familie der EF-Hand-Motif Proteine und zeichnen sich durch ähnliche Proteinstruktur und Sequenzhomologie aus. Cochleäre innere Haarzellen exprimieren die CaBPs 1, 2, 4 und 5. Genetische Deletion von CaBP4 resultiert in nur geringer Veränderung des Kalziumeinstroms und führt nicht zu Schwerhörigkeit. Mutationen in CaBP2 führen beim Menschen hingegen zu nichtsyndromischer autosomal-rezessiver Schwerhörigkeit (DFNB93). Eine momentan laufende Studie untersucht die zellulären Mechanismen dieser Schwerhörigkeit am Modell einer Mausmutante. Das Ziel des neuen Projektes ist es, eine tiefergehende Analyse der Funktion von CaBP2 und CaBP1 in der Regulation des Kalziumeinstroms und der Exozytose in Haarzellen der Maus sowie in der Schallkodierung durchzuführen. Um wesentliche biochemische Daten zu gewinnen werden wir die Sekundärstruktur von Wildtyp und mutierten CaBP2s mit CD-Spektroskopie und ihre Ca2+-Bindungseigenschaften mit mikroskaliger Thermophorese und fluorimetrischen Messungen untersuchen. Mit Hilfe der von kürzlich generierten CaBP2-Mausmutanten und Virus-vermitteltem Gentransfer in die embryonale Ohranlage werden wir die Regulation der CaV1.3 Kanäle durch Wildtyp und humanpathologische CaBP2-Mutanten analysieren. Das Hörvermögen von CaBP2-/- und CaBP1/2-/- Mäusen, welche verschiedene CaBP2-Konstrukte exprimieren, werden wir ausführlich auf der System- und Zellebene prüfen. Dabei werden wir die folgenden Methoden nutzen: Patch-Clamp-Messungen von Ca2+- und Ba2+-Strömen um die Kalziumstrominaktivierung zu charakterisieren, Messungen von Membrankapazitätsänderungen um Störungen der Haarzell-Exozytose aufzudecken und Ca2+-Imaging um präsynaptische Kalziumsignale zu untersuchen. Systemphysiologie und Ableitungen einzelner Hörnervenfasern in durch Expression von CaBP2-Mutanten geretteten CaBP1/2-Mäusen werden in Kollaboration innerhalb des Konsortiums (Dr. Nicola Strenzke) ausgeführt werden, um die Schallkodierung zu untersuchen. Schließlich wurde eine unterschiedliche Rolle der N- und C-terminalen Loben von Calmodulin beschrieben. Diesbezüglich sind für CaBPs zum heutigen Zeitpunkt nur unzureichende Daten verfügbar. Die vorhandenen CaBP2-Mutanten ermöglichen uns jetzt, die Funktion jedes Lobus des CaBP2-Protein getrennt zu untersuchen, um auf die Frage der potenziellen eigenen Funktionen näher einzugehen.
DFG-Verfahren
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