Substraterkennung und Spezifitätsmodulierung von Cullin4-RING E3 Ubiquitinligase-Substratrezeptoren
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Projekt beschäftigte sich mit Cullin4-RING Ubiquitinligasen (CRL4). CRL4 bestehen aus einem invarianten Kern, der sich aus der katalytischen Untereinheit (ROC1), einem Scaffold-Protein (Cullin4) und einem Adapterprotein (DDB1) zusammensetzt. An das Adapterprotein binden austauschbare Substratrezeptoren (DDB1 and Cullin4 associated factors, DCAFs), von denen ca. 50 verschiedene Exemplare im menschlichen Genom vorkommen. So können ausgehend von einem unveränderlichen Grundbaustein viele CRL4DCAF-Komplexe mit unterschiedlicher Substratspezifität aufgebaut werden. Die übergeordneten Fragestellungen des Projekts zielten auf die molekularen Mechanismen ab, wie einerseits bestimmte DCAFs Substrate erkennen, und wie andererseits virale Faktoren oder Pharmaka die Substratspezifität von CRL4 auf nicht-endogene „Fremdsubstrate“ umlenken. Solche Forschung ist relevant für das Verständnis endogener biologischer Funktionen von CRL4, z.B. DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Zellzyklusregulation, und hilft zudem, Vorgänge wie Virusreplikation, Viruspathogenese und Wirkungsmechanismen des zielgerichteten Proteinabbaus zu verstehen. In Abschnitt A wurde die Funktion des Substratrezeptors DCAF1 auf molekularer Ebene untersucht, und es konnte strukturell beschrieben werden, wie DCAF1 in CRL4 integriert ist. Abschnitt B beschäftigte sich mit den Mechanismen der CRL4-Spezifitätsänderung. Biochemische und strukturbiologische Analysen zeigten, wie das akzessorische Protein Vpr aus Affen- Immunodefizienzviren (SIV) CRL4 dahingehend remodelliert, dass Ubiquitylierung und proteasomaler Abbau des antiviralen Restriktionsfaktors SAMHD1 induziert wird. Strukturvergleiche mit verschiedenen Vpr-Orthologen aus SIV und HIV-2 demonstrierten eine starke Variabilität der jeweiligen SAMHD1-Erkennungsmechanismen, und lieferten dadurch direkte Einblicke in molekulare Virus-Wirt-Anpassungsprozesse. Weiterhin wurde aufgeklärt, wie der Cytomegalovirus-(CMV-)Faktor E27 endogene CRL4-Substratrezeptoren ersetzt, und dadurch den Transkriptionsfaktor STAT2 rekrutiert, eine zentrale Schaltstelle der antiviralen Interferonantwort, um dessen Ubiquitylierung und Abbau einzuleiten. Die Relevanz dieses zentralen CMV-Interferonresistenzmechanismus wurde in begleitenden zellulären und virologischen Untersuchungen bestätigt. Außerdem wurden in diesem Abschnitt die mechanistischen Grundlagen der synthetischen Spezifitätsmodulierung der Substratrezeptoren DCAF1 und DCAF16 untersucht. In Abschnitt C wurde die methodische Grundlage erbracht, um Ubiquitylierungssubstrate bisher unerforschter CRL4-Substratrezeptoren, sowie neue CRL4-Komponenten und Bindepartner zu beschreiben, basierend auf Ganzzell-Crosslinking und Proximity-Labeling in Kombination mit Proteomik und Crosslinking-Massenspektrometrie. Zuletzt konnte in einem Zusatzprojekt die Struktur eines anti-SARS-CoV2 Nanobodies in Komplex mit dem viralen Oberflächenprotein aufgeklärt werden, und dadurch die Neutralisierungsaktivität des Nanobodies erklärt werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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2019). Common mode of remodeling AAA ATPases p97/CDC48 by their disassembling cofactors ASPL/PUX1. Structure 27(12):1830-1841
Banchenko S, Arumughan A, Petrović S, Schwefel D, Wanker EE, Roske Y, Heinemann U
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(2021). Glial Synaptobrevin mediates peripheral nerve insulation, neural metabolic supply, and is required for motor function. Glia 69(8):1897-1915
Böhme MA, McCarthy AW, Blaum N, Berezeckaja M, Ponimaskine K, Schwefel D, Walter AM
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(2021). Potent neutralization of clinical isolates of SARS-CoV-2 D614 and G614 variants by a monomeric, sub-nanomolar affinity Nanobody. Sci Rep 11(1):3318
Valenzuela Nieto G, Jara R, Watterson D, Modhiran N, Amarilla AA, Himelreichs J, Khromykh AA, Salinas-Rebolledo C, Pinto T, Cheuquemilla Y, Margolles Y, López González Del Rey N, Miranda- Chacon Z, Cuevas A, Berking A, Deride C, González-Moraga S, Mancilla H, Maturana D, Langer A, Toledo JP, Müller A, Uberti B, Krall P, Ehrenfeld P, Blesa J, Chana-Cuevas P, Rehren G, Schwefel D, Fernandez LÁ, Rojas-Fernandez A
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(2021). Snapshots of native pre-50S ribosomes reveal a biogenesis factor network and evolutionary specialization. Mol Cell 81(6):1200-1215
Nikolay R, Hilal T, Schmidt S, Qin B, Schwefel D, Mielke T, Bürger J, Loerke J, Amikura K, Flügel T, Ueda T, Selbach M, Deuerling E, Spahn CMT
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(2021). Structural insights into Cullin4-RING ubiquitin ligase remodelling by Vpr from simian immunodeficiency viruses. PLoS Pathog 17(8):e1009775
Banchenko S, Krupp F, Gotthold C, Bürger J, Graziadei A, O'Reilly FJ, Sinn L, Ruda O, Rappsilber J, Spahn CMT, Mielke T, Taylor IA, Schwefel D
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(2022). An alpaca-derived nanobody recognizes a unique conserved epitope and retains potent activity against the SARS-CoV-2 omicron variant
Modhiran N, Lauer SM, Amarilla AA, Hewins P, Lopes van den Broek SI, Low YS, Thakur N, Liang B, Valenzuela Nieto G, Jung J, Paramitha D, Isaacs A, de Sng J, Song D, Jørgensen JT, Cheuquemilla Y, Bürger J, Andersen IV, Himelreichs J, Jara R, MacLoughlin R, Miranda-Chacon Z, Chana-Cuevas P, Kramer V, Spahn CMT, Mielke T, Khromykh AA, Munro T, Jones M, Young PR, Chappell K, Bailey D, Kjaer A, Herth MM, Jurado KA, Schwefel D, Rojas-Fernandez A, Watterson D
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(2022). Development and evaluation of an 18F-labeled nanobody to target SARS-CoV-2's spike protein. Front Nucl Med. 2
van den Broek SL, García-Vázquez R, Andersen IV, Valenzuela-Nieto G, Shalgunov V, Battisti UM, Schwefel D, Modhiran N, Kramer V, Cheuquemilla Y, Jara R, Salinas-Varas C, Amarilla AA, Watterson D, Rojas-Fernandez A, Herth MM
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(2022). HDLBP binds ER-targeted mRNAs by multivalent interactions to promote protein synthesis of transmembrane and secreted proteins. Nat Commun 13(1):2727
Zinnall U, Milek M, Minia I, Vieira-Vieira C, Müller S, Mastrobuoni G, Hazapis O, del Giudice S, Schwefel D, Stöhr N, Voigt F, Chao J, Kempa S, Hüttelmaier S, Selbach M, Landthaler M
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(2022). Targeted protein degradation by electrophilic PROTACs that stereoselectively and site-specifically engage DCAF1. J Am Chem Soc 144(40):18688-18699
Tao Y, Remillard D, Vinogradova EV, Yokoyama M, Banchenko S, Schwefel D, Melillo B, Schreiber SL, Zhang X, Cravatt BF
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(2023). Structural mechanism of CRL4-instructed STAT2 degradation via a novel cytomegaloviral DCAF receptor. EMBO J 2023 Mar 1;42(5):e11235
Le-Trilling VTK, Banchenko S, Paydar D, Leipe PM, Binting L, Lauer S, Graziadei A, Klingen R, Gotthold C, Bürger J, Bracht T, Sitek B, Lebbink RJ, Malyshkina A, Rappsilber J, Mielke T, Spahn CMT, Voigt S, Trilling M, Schwefel D
