Substraterkennung und –bindung durch die Signal-Peptid-Peptidase ähnliche Familie 2 (SPPL2)

• Antragstellerin: Professorin Dr. Regina Fluhrer
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 263531414

Die Signalpeptidpeptidase (SPP) und ihre homologen, die SPP-ähnlichen (SPPL) Proteasen, SPPL2a, SPPL2b, SPPL2c und SPPL3, gehören zur Familie der GxGD- Intramembranproteasen. In der ersten Förderperiode haben wir ein Proteom-weites Screening durchgeführt und eine Vielzahl von neuen potentiellen SPPL2a und SPPL2b Substraten identifiziert. Zusätzlich konnten wir für SPPL2c, eine bisher noch nicht untersuchte Protease, Substrate identifizieren und mittels Kandidatenansatz drei neue SPPL2a/b-Substrate validieren und die C-terminalen SPPL2-Schnittstellen bestimmen. Die Analyse von chimären Proteinen aus dem etablierten SPPL2-Substrat TNF und dem Nicht-Substrat Bri3 sowie die von mutierten TNFalpha-Substraten legt ein mehrstufiges Spaltungsmodell für die Substratprozessierung durch SPPL2b nah, das für jeden Schritt individuelle Substrat-Determinanten erfordert. Während die Bindung von Typ II Volllängen-Substraten an das Enzym eher unspezifisch zu erfolgen scheint, wird die Substraterkennung im aktiven Zentrum durch eine kurze luminale Substratdomäne begünstigt. Die initialen Spaltungen am C-terminalen Ende der TM-Domäne der Substrate werden durch die Aminosäuren 8-14 der luminalen Juxtamembran-Domäne der Substrate bestimmt. Ob das Substrat anschließend innerhalb seiner TM-Domäne eine konsekutive Spaltung erfährt, wird durch die helikale Stabilität der TM-Domäne bestimmt. Und schließlich hängt die Stabilität der Spaltprodukte und somit höchstwahrscheinlich auch eine mögliche Signalgebung von einer S-Palmitoylierung an der cytosolischen TM-Grenze des Substrats ab.Ziel 1: In der neuen Förderperiode werden wir die neu identifizierten SPPL2-Kandidatensubstrate in unseren etablierten Zellkulturmodellen sowie in unserer neu etablierten SPPL2a/b-Doppel-Knockout-Zelllinie validieren. Ziel 2: Da unser postuliertes Modell für die Proteolyse von SPPL2b-Substraten hauptsächlich auf der Analyse von TNFalpha basiert, werden wir gezielte Änderungen an anderen Substraten vornehmen, um die Allgemeingültigkeit unserer Ergebnisse zu bestätigen. Schließlich wollen wir das Nicht-Substrat Bri3 durch Einführen möglichst weniger Mutationen in ein SPPL2-Substrat umwandeln.Ziel 3: Während SPPL2b bevorzugt Substrate mit einer kurzen luminalen Juxtamembran-Domäne prozessiert, akzeptiert SPPL3 Substrate unabhängig von der Länge ihrer Ektodomäne. Auf dieser Basis werden wir SPPL2/SPPL3-chimäre Proteine etablieren, um die Domänen zu identifizieren, die für die Selektion von Substraten mit kurzen Ektodomänen verantwortlich sind. Insgesamt wird Projekt P2 einen detaillierteren Einblick in die Substrat-Determinanten geben, die eine Erkennung und Spaltung durch SPPL2-Proteasen ermöglichen und helfen zu verstehen, wie Protease und Substrat interagieren. Somit trägt das Projekt P2 zu den zwei Hauptzielen der Forschungsgruppe bei und hilft, den molekularen Mechanismus der intramembranären Spaltung weiter zu entschlüsseln.

• DFG-Verfahren: Forschungsgruppen
• Teilprojekt zu: FOR 2290: Intramembrane Proteolyse Verstehen