Duale Rolle des pestiviralen Nichtstrukturproteins NS4A bei RNA Replikation und Virionmorphogenese

• Antragsteller: Professor Dr. Norbert Tautz
• Fachliche Zuordnung: Virologie
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 280799249

Bei allen Viren der Familie Flaviviridae sind neben den Strukturproteinen auch die Nichtstrukturproteine (NSPs) für die Bildung infektiöser Partikel essentiell. Somit kommt den NSPs eine duale Funktion sowohl in der Genomreplikation als auch in der Virionmorphogenese zu. Die Klärung der molekulare Basis dieser Multifunktionalität, ist Ziel unserer Arbeiten. Bei Pestiviren entscheidet die Spaltung des NS2-3 über dessen Funktion: Während ungespaltenes NS2-3 für die Bildung infektiöser Partikel benötigt wird, ist freies NS3 essentiell für die RNA Replikation. Anhand einer selektierten Virusmutante, welche trotz vollständiger NS2-3 Spaltung Virionen generieren kann, konnten wir nachweisen, dass NS3/NS4A Oberflächeninteraktionen darüber entscheiden, ob der NS3/4A Komplex in RNA Replikasekomplexen oder in der Virionmorphogenese aktiv ist. In einer detaillierten funktionellen Charakterisierung der C-terminalen Domäne des NS4A von BVDV wurde untersucht, welche Aminosäuren für dessen Funktion als (I) NS3 Proteasekofaktor, (II) als Replikasebaustein, oder (III) als Komponente in der Vironmorphogenese kritisch sind. Diese Arbeiten sollen in der zweiten Antragsphase abgeschlossen werden. Zentraler Aspekt des Antrags ist die Identifikation der Zusammensetzung der Replikase- und Verpackungskomplexe, insbesondere die Charakterisierung der beiden monovalenten NS3/4A Komplexvarianten (aktiv in Replikase oder Virionmorphogenese) bezüglich ihrer individuellen viralen Interaktionspartner und der daran beteiligten Proteinoberflächen. Geplante Techniken sind Protein-„Crosslinking“ über „orthogonales Protein-labeling“ und „Biotin-Ligase Proteinfusionen“. Bisherige Untersuchungen ergaben, dass die „gain-of-function“ Mutationen in NS2 und NS3 für die Virionmorphogenese, zu einer verstärkten NS2 /NS3 Interaktion führen. Weiterhin zeigten diese Untersuchungen, dass eine C-terminale Verkürzung des NS4A, zu einer massiv gesteigerten Bindung zwischen NS2 und NS3 führt. Zusammenfassend weisen die Daten darauf hin, dass NS2 und der C-terminale NS4A Bereich um die Bindung an dieselbe, oder sich überlappende NS3 Oberflächen konkurrieren. Der an diese NS3 Oberfläche bindende Interaktionspartner entscheidet somit über die Funktionalisierung der Komplexe in Richtung Virionmorphogenese oder RNA-Replikasezusammenbau. Die Interaktion zwischen NS2 und NS3/4A soll durch Mutagenese der NS3 und NS4A Oberflächen weiter charakterisiert werden. Identifizierte kritische Aminosäuren werden mittels „orthogonalem Protein-labeling“ auf die Bindung weiterer viraler Proteine untersucht. Die molekulare Basis der Multifunktionalität viraler Proteine ist von hoher wissenschaftlicher Relevanz, da davon auszugehen ist, dass das zugrundeliegende Prinzip der hier beobachteten Funktionalisierung von Proteinkomplexen mittels selektiver Rekrutierung von Interaktionspartnern durch multifunktionelle Interaktionsflächen, auch in den Polyproteinen anderer positiv-Strang RNA Viren und Retroviren Anwendung findet.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortlich: Dr. Olaf Isken