Spannungs- und pH-Steuerung des Hv1 Protonenkanals

• Antragsteller: Dr. Thomas K. Berger
• Fachliche Zuordnung: Biophysik
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 282132635

Der Protonenkanal Hv1 gehört zur Familie der spannungsgesteuerten Ionenkanäle und ist in vielen unterschiedlichen Zelltypen exprimiert. Hv1 kontrolliert die Säuresekretion in Lungenepithelzellen, den intrazellulären pH-Wert und die Reifung humaner Spermien, die Histaminsekretion in Basophilen, sowie die angeborene Immunantwort von Makrophagen wie Microglia. Die Struktur von Hv1 ist einzigartig: Der Kanal besitzt eine Spannungssensor-Domäne (voltage-sensing domain), aber keine Poren-Domäne. Ich konnte zeigen, dass der Selektivitätsfilter in den Transmembran-Segmenten S1 und S4 von mindestens zwei Aminosäuren gebildet wird, die erst während der Kanalöffnung interagieren (Berger & Isacoff, Neuron 2011). Des Weiteren konnte ich zeigen, dass eine Bewegung von S1 entscheidend für die Öffnung des Kanals ist (Mony*, Berger* & Isacoff, Nat Struct Mol Biol 2015). Die Spannungsabhängigkeit von Hv1 wird durch den pH-Gradienten über der Membran bestimmt. Ein Ansäuern des Zytosols um z.B. eine pH Einheit verschiebt die Aktivierungskurve um ca. -40 mV. Diese pH-Abhängigkeit der Aktivierung ist entscheidend für die Physiologie von Hv1. Wie der Kanal den pH-Gradienten registriert, ist unbekannt. Der molekulare Mechanismus soll daher im Rahmen dieses Antrags aufgeklärt werden. In Projekt 1 werde ich bestimmen, welche Aktivierungszustände pH-abhängig sind; der Übergang vom geschlossenen in den offenen Zustand erfolgt über mindestens zwei Konformationsänderungen. Mithilfe der Patch-Clamp-Fluorometrie (Berger & Isacoff Meth Mol Biol 2015) sowie der "substituted cysteine accessibility" Methode werde ich untersuchen, welche dieser Konformationsänderungen pH-abhängig sind. Beide Methoden habe ich für Hv1 bereits etabliert. Zusätzlich werde ich Konformationsänderungen mit Hilfe von fluoreszenten unnatürlichen Aminosäuren detektieren. In Projekt 2 soll der pH-Sensor von Hv1 identifiziert werden. Entscheidend dafür ist, zu verstehen, wie Spannungs- und pH-Detektion gekoppelt sind. Dazu möchte ich den Hv1-Kanal so modifizieren, dass die Spannungs- nicht aber die pH-Abhängigkeit erhalten bleibt; ich werde gezielt einzelne oder mehrere Mutationen in Hv1 einführen und Chimäre aus Hv1 sowie Teilen anderer Ionenkanäle herstellen. Im Rahmen dieses Forschungsvorhabens werden somit zentrale Fragestellungen zur Biophysik von Hv1 mit modernen elektrophysiologischen, fluoreszenzoptischen und molekularen Methoden untersucht. Die Erkenntnisse werden das Verständnis von Spannungssensoren-Domänen im Allgemeinen und von Hv1 im Speziellen erweitern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen