Detailseite
Projekt
Erweiterung des genetischen Codes für Protein-Protein und Protein-DNA Interaktionsstudien in dynamischen zellulären Systemen
Antragstellerinnen / Antragsteller
Dr. Sebastian Bultmann; Professorin Dr. Kathrin Lang
Fachliche Zuordnung
Biologische und Biomimetische Chemie
Förderung
Förderung von 2015 bis 2020
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 283300243
Der gezielte Einbau von unnatürlichen Aminosäuren (UAS) in Proteine von Zellen und Organismen durch die Erweiterung des genetischen Codes, hat neue Einblicke in biologische Prozesse geschaffen, die mit klassischen Methoden schwierig bis unmöglich adressierbar gewesen wären. Neueste Entwicklungen, wie die genetische Manipulation des Escherichia coli Genoms und der Knockout des bakteriellen Release Faktors RF1, haben immens zur Effizienzsteigerung der Inkorporation von UAS durch Amber Suppression in Bakterien beigetragen. Der effiziente, hoch effektive und zielgerichtete Einbau von UAS in Proteine von Säugerzellen stellt jedoch immer noch eine große Herausforderung da. Allerdings konnte mit einem kürzlich veröffentlichten, optimierten System gezeigt werden, dass die Proteinausbeute erhöht und die Expansion des genetischen Codes in Säugerzellen verbessert werden kann. Alle aktuellen Systeme für den Einbau von UAS in Säugerzellen beruhen jedoch auf transienter Transfektion. Dies führt zu variablen Expressionsausbeuten, limitiert die Anwendung auf kleinere Maßstäbe, bietet keine (oder nur aufwendige) Möglichkeiten für High Content- (z.B. Proteomics) oder Screening-Ansätze und ist damit nicht geeignet dynamische biologische Prozesse (z.B. Differenzierung) zu untersuchen.Um diese Einschränkungen zu überwinden, schlagen wir vor, ein stabil integriertes System für den gezielten Einbau von UAS in Proteine von Säugerzellen zu entwickeln. Zusätzlich werden wir neue Ansätze und bioorthogonale Reaktionen für die Untersuchung von Protein-Protein und Protein-DNA Interaktionen in lebenden Zellen mittels photoreaktiver Gruppen entwickeln. Die Kombination dieser Herangehensweisen wird uns erlauben, transiente und schwache Proteininteraktionen, sowie die räumliche und zeitliche Abhängigkeit der Lokalisation und Kinetik von Zielproteinen während dynamischer biologischer Prozesse zu untersuchen. Um dies zu erreichen werden wir (i) das Pyrrolysyl tRNA Synthetase (PylRS)/tRNA System mittels CRISPR/Cas unterstützter genetischer Manipulation stabil in präzise genomische Loci von murinen und humanen Zellen einbringen; (ii) neue photoinduzierbare bioorthogonale Reaktionen entwickeln, die Untersuchen spezifischer DNA-Protein Interaktionen mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung ermöglichen; um schließlich (iii) das stabile PylRS/tRNA System mit den neu entwickelten photoinduzierbaren Derivaten zu kombinieren um die Lokalisation und Proteininteraktionen der DNA Methyltransferase DNMT3B während der Epiblastenentwicklung zu untersuchen. Das vorgeschlagene Projekt wird die Anwendbarkeit der Expansion des genetischen Codes auf hoch dynamische Prozesse, sowie umfangreiche Experimente in Säugerzellen erweitern und die neuentwickelten bioorthogonalen Reaktionen werden ein wertvolles Hilfsmittel zur Untersuchung der Lokalisation und Kinetik von DNA-interagierenden Faktoren darstellen.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
