Die Regulation bakterieller RNA Polymerase durch Transkriptionsfaktoren

• Antragsteller: Professor Dr. Paul Rösch
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 284071855

Das Projekt soll zur Aufklärung der Mechanismen auf atomarer Ebene der bakteriellen DNA:RNA Transkription beitragen, insbesondere zur Aufklärung der Regulation der Übergänge der einzelnen Schritte der Transkription und der diese Übergänge begleitenden strukturellen Veränderungen der beteiligten Proteine. Unter den Fernzielen des Projektes ist auch die Schaffung von Grundlagen für die Entwicklung neuer antimikrobieller Wirkstoffe. Für diese Untersuchungen werden spektroskopische, biochemische und molekularbiologische Methoden eingesetzt. Der Fokus liegt auf dem Studium der Interaktion der RNA Polymerase (RNAP) mit Nus-Faktoren und verwandten Proteinen mithilfe der magnetischen Kernresonanzspektroskopie (NMR Spektroskopie) in Lösung. Das klassische Methodenarsenal der NMR Spektroskopie wird hierzu erweitert werden durch Schemata zur spezifischen und unspezifischen Isotopenmarkierung von Proteinen mit 13C und 15N, kombiniert mit Perdeuterierung. Insbesondere die RNAP soll durch separate Expression der Untereinheiten, 13C-Markierung ihrer Methylgruppen und Rekonstitution des intakten multimeren Proteins der NMR Spektroskopie zugänglich gemacht werden. Ähnlich sollen die Ligandenproteine durch 13C Markierung im Komplex mit RNAP detektierbar gemacht werden, so dass die Interaktionsflächen der Proteine mit RNAP und die Geometrie der Komplexe möglichst genau beschrieben werden kann. Ergänzt werden diese Experimente durch eine Palette von biochemischen, molekularbiologischen und in vivo Verfahren sowie durch Modellierungsansätze, molekulares docking und Moleküldynamkrechnungen. Gerichtete Variation einzelner Aminosäuren der beteiligten Proteine und Untersuchung von Fragmenten der RNAP und der Ligandenproteine werden eine zentrale Rolle spielen, unterstützt von chemischen cross-linking Experimenten. Fluoreszenzspektroskopie entsprechend markierter oder intrinsisch ausreichend fluoreszierender Proteine und Wechselwirkungsstudien mit Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) werden eine genauere Beschreibung der gegenseitigen Wechselwirkung der Ligandenproteine auch im Komplex mit RNAP erlauben. Die Studien werden sich auch auf das Protein RfaH erstrecken, das eine bisher bei anderen Proteine unbeobachtete Eigenschaft der Proteinfaltung zeigt, den reversiblen Übergang der alpha-helikalen Konformation einer kompletten Domäne in eine beta-Strang Konformation. Dieses bisher einzigartige Verhalten des Proteins RfaH soll näher untersucht werden, insbesondere sollen die Aminosäuren identifiziert werden, die diese Übergänge ermöglichen. Es sollen die Vorgänge bei der Transkription gefunden werden, die den konformationellen Übergang und damit die Aktivierung von RfaH in der Transkription auslösen. Komplexe Wechselwirkung zwischen speziellen DNA Sequenzen, der RNAP und RfaH spielen hierbei vermutlich eine zentrale Rolle.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen