Einzelmoleküluntersuchungen der eukaryotischen Transkriptionsinitiation

• Antragsteller: Professor Dr. Jens Michaelis
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Biophysik
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 286540087

Die Kontrolle der Genexpression ist von außergewöhnlicher Bedeutung für jede eukaryotische Zelle und das Verständnis der molekularen Mechanismen, die dieser Kontrolle zur Grunde liegen ist das zentrale Ziel dieses Forschungsvorhabens. Während strukturelle Untersuchungen zu einem genauem Verständnis der molekularen Mechanismen bei der Transkriptionselongation geführt haben, traten bei der strukturellen Untersuchung von Transkriptionsinitiationskomplexen größere Schwierigkeiten auf, da viele unterschiedliche Faktoren an dem Prozeß beteiligt sind, und die Initiationskomplexe hoch dynamisch sind und Konformationsumwandlungen zeigen. Daher verspricht man sich von hybriden Strukturmethoden zusätzliche Möglichkeiten. Eine exzellente Methode hierfür ist auch die Einzelmolekülfluoreszenz, da mit dieser Echtzeitinformation zur Dynamik einzelner Komplexe erhalten werden kann, und auch strukturelle Information von transienten Strukturen zugänglich ist. In den vorgestellten Experimenten soll die Methode der Einzelmolekülfluoreszenz und des Nanopositionierungssystems (NPS) verwenden werden, um strukturelle und mechanistische Einblicke in die Transkriptionsinitiation in Eukaryoten zu erhalten.Zunächst werden wir die Limitierung bisheriger NPS Experimente zur eukaryotischen Transkription dadurch aufheben, daß wir Strategien entwickeln RNA Polymerase II (Pol II) Komplexe mit an verschiedenen Stellen durch enzymatische Reaktion befestigten Farbstoffmoleküle herzustellen. Mit Hilfe dieser Technik werden wir dann die mechanistische Rolle von TFIIF und TFIIE bezüglich der Kontrolle der Position der sogenannten downstream DNA während der Transkriptionsinitiation klären. Dabei werden wir unterschiedliche gekürzte Mutanten von TFIIF verwenden um den Einfluß der jeweiligen Domäne zu bestimmen. Außerdem werden wir durch Variation der DNA Sequenz herausfinden, in welcher Weise TFIIF die Wahl des Startpunktes für die Transkription kontrolliert.In einer zweiten Studie werden wir funktionelle in-vitro Transkriptionsinitiationskomplexe bestehend aus Pol II, TBP, TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH und Promoter DNA, assemblieren, wobei alle Komponenten von hochrein sind. Mit diesen Komplexen werden wir den Übergang vom geschlossenen in den offenen Initiationskomplex untersuchen. Hierbei wird es uns wieder die Methode des smFRET ermöglichen die entscheidenden Konformationsumwandlungen des Komplexes zu beobachten um ein mechanistisches Verständnis zu erhalten. Insbesondere werden wir mit den smFRET Experimenten das Schmelzen der DNA in den Komplexen untersuchen, das aufgrund der Aktivität von TFIIH auftritt. Die dabei auftretenden Konformationsumwandlungen im Komplex werden wir in Echtzeit untersuchen und Zustände, die wichtig für den Übergang vom geschlossenen zum offenen Komplex sind, möchten wir mit Hilfe von NPS strukturell analysieren. Zusammenfassend werden uns die vorgestellten Experimente einen mechanistischen Einblick in die Transkriptionsinitiation in Eukaryoten geben.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen