Untersuchung des Zusammenhangs von E3 Ligase- und mRNA Degradationsfunktion der Roquinproteine

• Antragsteller: Professor Dr. Vigo Heissmeyer
• Fachliche Zuordnung: Immunologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 287078900

Roquinproteine beugen der Entstehung von Autoimmunerkrankungen vor und kontrollieren die spontane T Zellaktivierung, sowie die unangemessene T Zelldifferenzierung. Roquin-1 und sein Paralog Roquin-2 teilen sich ein sehr ähnliche Domänenstruktur im N-terminalen Bereich, die eine kürzlich charakterisierte RNA-Bindedomäne namens ROQ und einen RING Finger umfassen. Während bereits eine große Anzahl von Publikationen gezeigt hat, dass Roquin mit seiner ROQ Domäne direkt an Cis-Elemente von Ziel-mRNAs bindet, um deren Degradation einzuleiten, ist die Wichtigkeit der mutmaßlichen E3 Ligaseaktivität von Roquin-1 vollkommen unverstanden. In diesem Antrag werden wir daher die E3 Ligasesubstrate und Kofaktoren von Roquin-1 und -2 identifizieren und deren Aktivität in T Zellen untersuchen. Hierfür werden wir eine neu etablierte Methode namens BioID anwenden, die es erlaubt jene Proteine zu biotinylieren und aufzureinigen, die innerhalb der Zellen in nächster Nähe zu Roquin gewesen sind. Die Analyse der daraus resultierenden massenspektrometrischen Daten werden wir auf die Anreicherung von Peptiden von bereits bekannten Roquin Zielgenen untersuchen, um diese dann mit Informationen aus Ribosomen Profiling- und Next Generation Sequencing Experimenten zu vergleichen. Mittels dieser bioinformatischen Vergleiche werden wir herausfinden ob die Expression von Roquinzielgenen durch kotranslationale Ubiquitinierung von entstehenden Polypeptiden inhibiert wird. Des Weiteren wird auf diese Weise klar gezeigt werden, ob die ROQ Domäne und der RING Finger in unterschiedliche oder gleichgerichtete regulatorische Prozesse eingreifen. Ein weiterer zentraler Punkt dieses Antrags wird die Validierung und die eingehende Untersuchung der Bedeutung der zellulären Interaktionen von Roquin mit seinen E3 Ligasesubstraten und Kofaktoren sein, welche in BioID Experimenten gefunden und in dem CRISPR/Cas9 Screen unserer eigenen Vorarbeiten identifiziert wurden. Diese Experimente sollen einen Beitrag leisten, um neue mögliche Ziele der Immunmodulation zu evaluieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen