High Content genomweiter RNAi Screen der Parkin abhängigen Eliminierung von depolarisierten Mitochondrien
Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Dieses Projekt zielte darauf Modulatoren der Parkin vermittelten Mitophagie zu finden und zu untersuchen. Der sequentielle Prozess der Autophagie von geschädigten Mitochondrien (Mitophagie) wird im Zellmodell an zwei distinkten Zeitpunkten untersucht: der frühe Zeitpunkt 2h nach Depolarisation und der späte Zeitpunkt 24h nach Depolarisation. Proteine, wie PINK1, Parkin, Ubiquitin, E2 Ubiquitin-konjugierenden Enzyme oder mitochondriale Oberflächenproteine (z.B. VDAC1, TOM20 oder TOM70), sind essentiell für den frühen Zeitpunkt der Mitophagie, weshalb deren Funktion intensiv detailliert erforscht wurde. Innerhalb dieses Projektes wurde der Modulator USP36 (ubiquitin specific protease 36) gefunden, der den späten Zeitpunkt der Mitophagie, die Eliminierung von den fehlerhaften Organellen nach 24h Depolarisation, verhindert. Interessanterweise ist das DUB (De-ubiquitinierungsenzyme) USP36 im Nukleus zu finden und wirkt nicht direkt an ubiquitinierten zytosolisch lokalisierten Mitochondrien. Vielmehr vermittelt das Fehlen von USP36 eine Veränderung eines epigenetischen Markers: die Ubiquitinierung von Histon 2B an Lysin 120 (H2B-K120Ub). Dieser Marker ist mit aktiv transkribierten Genen assoziiert. Hierbei bewirkt die Herunterregulation von USP36 eine signifikante Veränderung der globalen Genexpression. 1019 Gene zeigten eine differentielle Expression, unter anderem die Autophagiegene ATG14L und Beclin-1. Weitere molekulare Untersuchungen des Signalweges zeigten, dass die Verringerung der Expression dieser essentiellen Autophagieproteine ursächlich für die fehlerhafte Mitophagie nach USP36 Herunterregulation ist. Weitere Anstrengungen müssen unternommen werden, um zusätzliche Faktoren zu finden, welche die späten Zeitpunkte der Mitophagie beeinflussen. Dafür müssen geeignete Screens etabliert werden. In diesem Projekt wurde ein neuer Ansatz eines Screens der Mitophagie nach 24h Depolarisation getestet. In diesem FACS (fluorescence-activated cell sorting) basiertem Assay werden Mitophagie positive oder negative Zellen aufgrund von Unterschieden in den Fluoreszenzintensitäten von gefärbten Mitochondrien erkannt und sortiert. Durch die finale Etablierung und Umsetzung dieses Ansatzes können weitere Kandidaten im sequentiellen Prozess der Mitophagie gefunden werden und somit das Gesamtbild der Mitophagie komplettiert und besser verstanden werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2017), Harnessing human ADAR2 for RNA repair – Recoding a PINK1 mutation rescues mitophagy. Nucleic Acids Res. 45(5), 2797-2808
Wettengel J, Reautschnig P, Geisler S, Kahle PJ, Stafforst T
(Siehe online unter https://doi.org/10.1093/nar/gkw911) - (2019), PINK1 Regulates Dopamine and Lipids at Mitochondria to Maintain Synapses and Neuronal Function
Bus C, Geisler S, Feldkaemper M, Flores-Romero H, Schaedler A, Zittlau K, Zarani M, Uysal B, Casadei N, Fallier-Becker P, Schwarz L, Brouwers JF, Koch H, Ugun-Klusek A, Maruszczak K, Vogt Weisenhorn DM, Wurst W, Schmidt B, Martens G, Brügger B, Rapaport D, Garcia A, Macek B, Krüger R, Gasser T, Kahle PJ, Fitzgerald CJ
(Siehe online unter https://doi.org/10.1101/814343) - (2019), Ubiquitin-specific protease USP36 knockdown impairs Parkin-dependent mitophagy via downregulation of Beclin-1-associated autophagy-related ATG14L. Exp Cell Res. 384(2):111641
Geisler S, Jäger L, Golombek S, Nakanishi E, Hans F, Casadei N, Terradas AL, Linnemann C, Kahle PJ
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2019.111641)
