High Content genomweiter RNAi Screen der Parkin abhängigen Eliminierung von depolarisierten Mitochondrien

• Antragsteller: Dr. Sven Geisler
• Fachliche Zuordnung: Molekulare und zelluläre Neurologie und Neuropathologie ; Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 288418809

Dieses Projekt zielt darauf neue Modulatoren der PINK1/Parkin abhängigen Eliminierung von depolarisierten Mitochondrien (Mitophagie) zu finden und zu untersuchen. Die Ursachen der sporadischen Parkinsonschen Krankheit sind noch weitgehend ungeklärt. Anhand von monogenetischen Formen der Parkinsonschen Krankheit lassen sich molekularen Ursachen der Krankheitsentstehung leicht untersuchen. So wurde in Patienten mit Mutationen und Funktionsverlust der monogenetischen rezessiven Genprodukte PINK1 und Parkin, eine Fehlregulation der mitochondrialen Funktion und Homöostase beobachtet. Daraus resultierende dysfunktionale Mitochondrien könnten zum Absterben der Neuronen beitragen. Ohne einen präzisen Mechanismus ist es für die Zelle nicht möglich, fehlerhafte Mitochondrien zu erkennen und abzubauen und damit die Aufrechterhaltung eines gesunden mitochondrialen Netzwerkes zu gewährleisten. Im Zellkulturmodell kann eine mitochondriale Fehlfunktion durch Entkopplung des mitochondrialen Membranepotentials mit Hilfe des Protonophores CCCP simuliert werden. Hierbei setzt eine PINK1 und Parkin abhängige Kaskade ein, um nicht funktionierende Mitochondrien zu entfernen. Zuerst werden PINK1 und Parkin auf den Mitochondrien stabilisiert, was zu einer Markierung der Organellen mit Ubiquitin führt. Dies dient als Signal für die Autophagiemaschinerie der Zelle um letztendlich die fehlerhaften Organellen im Lysosome abzubauen. In einem etablierten zellulären Modell der mitochondrialen Depolarisation wird häufig der 2h Zeitpunkt (Parkin-Translokation) und der 24h Zeitpunkt (Mitophagie) nach CCCP Behandlung untersucht. In den letzten Jahren wurden RNAi basierende High-Content-Imaging-Screens des 2h Zeitpunktes durchgeführt. Hierbei wurden zahlreiche neue regulatorische Proteine der Parkin-Translokation gefunden und das Wissen über die zeitlich früh ablaufenden molekularen Prozesse der Mitophagie konnte stark erweitert werden. Der andere weniger untersuchte interessante Zeitpunkt ist die vollständige Eliminierung der Mitochondrien nach 24 Stunden Depolarisation. Soweit uns bekannt ist, wurde noch kein Screen der finalen Mitophagie unter Verwendung einer genomweiten RNAi Bibliothek durchgeführt. Wir werden solch einen Screen für den finalen Schritt der Mitophagie etablieren und neue regulatorische Proteine identifizieren. Anschließend erfolgt die molekulare Charakterisierung der Funktion(en) von aussichtsreichen Modulatoren. Hierbei wird ihre genaue Funktion, Lokalisation, Interaktionen und Aktivität im Mitophagiemodell mit unterschiedlichen Methoden ermittelt. Wir werden entsprechend mit Inhibitoren oder Stimulatoren versuchen diese Funktionen zu regulieren um eine fehlerhafte Eliminierung von Mitochondrien wieder herzustellen. Somit würden neue regulatorische Proteinen, die an der finalen Eliminierung der Mitochondrien im Prozess der Mitophagie beteiligt sind, identifiziert werden und sich eine differenziertere Sicht auf den gesamten Prozess der Mitophagie ergeben.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortlich: Dr. Shushant Jain