Structural biology of vertebrate cGAS/Mab21 proteins and their ligand complexes
Biochemistry
Final Report Abstract
Die Erkennung viraler und bakterieller Nukleinsäuren durch intrazelluläre Sensoren des angeborenen Immunsystems schützt uns vor Infektionen, allerdings kann die Erkennung körpereigener Nukleinsäuren zu Autoimmunerkrankungen und Entzündungsreaktionen in Krebsgewebe führen. Aus diesem Grund sind zugrundeliegende molekulare Mechanismen der Erkennung pathogener bzw. körpereigener Nukleinsäuren nicht nur aus Sicht von Grundlagenforschung interessant, sondern vor allem auch von biomedizinischer Relevanz. Hierbei ist z.B. die Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Nukleinsäure- Derivate als Adjuvanzien in der Krebsimmunotherapie, oder der Effekt von mRNA Vakzinen auf das angeborene Immunsystem von zentralem therapeutischem Interesse. Intrazelluläre Nukleinsäuresensoren des angeborenen Immunsystem sind u. a. cGAS (cyclic-GMP-AMP Synthetase) und RIG-I (Retinoic Acid Inducible I), welche zytosolische DNA bzw. zytosolische virale RNA erkennen und Teil dieses Forschungsprojektes waren. Hauptziel diese Projektantrags war es herauszufinden, wie der intrazelluläre DNA Sensor cGAS durch unterschiedliche DNA Moleküle aktiviert wird, sowie allgemeine strukturelle Mechanismen der cGAS-MAB21 Familie zu klären. Wir hatten die grundlegende Struktur des DNA Sensors cGAS und seines DNA Komplexes 2013 bestimmt und publiziert. Hierbei zeigte sich, dass cGAS 12-16 Basepaare doppelsträngiger DNA bindet und über eine Konformationsänderung aktiviert wird. Allerdings aktiviert DNA <20bp cGAS in Zellen nicht, wohingegen lange DNA (Plasmid DNA) ein sehr guter cGAS Aktivator ist. Dies war aus den ersten Kristallstrukturen nicht erklärbar, wir hatten jedoch die Vermutung, dass kooperative Mechanismen entlang längerer DNA den aktiven Zustand von cGAS stabilisieren. Mit Hilfe von Kristallstrukturen mit 39bp DNA, sowie biochemischen und zellbiologischen Untersuchungen konnten wir zeigen, dass cGAS entlang längerer DNA Multimere bildet, welche sich über Protein-Protein und Protein-DNA Interaktionen kooperative stabilisieren. Dieser Mechanismus „konzentriert“ cGAS auf langer DNA und stabilisiert so aktive cGAS Dimere. Dabei zeigte sich ebenso, dass Proteine, welche DNA knicken (TFAM, HMG Proteine), die Bildung von cGAS Dimeren fördern und somit Immunreaktionen beeinflussen können. Dies ist insbesondere im Kontext von mitochondrialer DNA interessant, welche durch TFAM strukturell organisiert wird und eine wesentliche Quelle von selbst- Liganden von cGAS ist. Zusammenfassend haben wir ein allgemeines Modell für cGAS formuliert, welches nun über den beschriebenen kooperativen Mechanismus die Aktivierung von cGAS durch unterschiedliche DNA Liganden beschreiben kann und hilft, bislang unerklärte biochemische Eigenschaften von cGAS zu verstehen. Wir postulieren, dass die von uns formulierten Mechanismen auch molekulare Grundlagen der später in Zellen beobachteten cGAS Kondensate sind. Desweiteren konnten wir aufklären, weshalb cGAS nicht von chromosomaler DNA im Zellkern aktiviert wird, obwohl in den letzten Jahren bekannt wurde, dass cGAS – paradoxerweise – ein vornehmlich kernständiges Protein ist. Mit Kryoelektronenmikroskopie bestimmten wir den Komplex von cGAS mit Nukleosomen. Wir konnten zeigen, dass Nukleosomen cGAS hochaffin, aber in einer inaktiven Konformation binden, und zwar so, dass cGAS von weiteren DNA Interaktionen abgeschirmt ist. Nukleosomen sind also hochpotente Inhibitoren von cGAS. Neben diesen zentralen Ergebnissen zu cGAS konnten wir im Rahmen dieses Projektes eine erste Struktur eines weiteren MAB21 Proteins (MAB21-L1) bestimmen, wo sich zeigte, dass diese Proteine vermutlich dekamere Strukturen ausbilden können, sowie zur Rolle von RIG-I in der Erkennung endogener RNA und Autoimmunität beitragen.
Publications
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