Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des MET Rezeptors mit Hilfe künstlicher Liganden

• Antragsteller: Professor Dr. Hartmut Niemann
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 288981880

Für membranständige Rezeptoren mit einer Transmembranhelix wie den Epo Rezeptor oder verschiedene Rezeptor Tyrosinkinasen (RTKs) wird diskutiert, ob eine einfach Dimerisierung ihrer extrazellulären Domänen für die intrazelluläre Signalweiterleitung ausreicht. Alternativ könnte eine bestimmte Anordnung der beiden Ektodomänen nötig sein, die z.B. eine Drehung der Transmembranhelices relativ zu einander bewirkt. Für einige RTKs ist neben der Dimerisierung durch Liganden ein weiterer Dimerisierungkontakt notwendig, der von membrannahen Domänen des Rezeptors vermittelt wird.Ähnliche Fragen stellen sich für die RTK MET. Die Kristallstruktur eines signalaktiven 2:2 Komplexes existiert bisher nur mit dem bakteriellen Liganden InlB, einem MET-aktivierenden Invasionsprotein aus Listeria monocytogenes. Strukturen eines MET Dimers mit dem endogenen Liganden Hepatozyten Wachstumsfaktor (HGF) sind nicht bekannt. Viele Fragen in Bezug auf die strukturellen Grundlagen der MET Aktivierung sind noch ungeklärt, z.B. ist die Struktur von zwei membrannahen extrazellulären Domänen unbekannt. Auch ist unklar, ob und ggf. wie die vier Ig-ähnlichen IPT Domänen, denen häufig lediglich eine Platzhalterfunktion zuerkannt wird, durch Dimerisierungskontakte zur Aktivierung beitragen.Künstliche MET Liganden können helfen, diese Fragen zu beantworten. Aus Kooperationen mit Prof. Gherardi und Prof. Plückthun verfügen wir über einen Satz an künstlichen MET Bindern. Es handelt sich um zwei agonistische Schafsantikörper mit sehr hoher Affinität zu MET und um Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins). Nicht-agonistische Binder (monomere Fab Fragmente und DARPins) sollen als Kristallisationschaperone die Kristallisation der vollständigen MET Ektodomäne fördern. Dies würde die Strukturbestimmung der beiden membrannahen IPT Domäne ermöglichen. Ausgehend von den Schafsantikörpern haben wir dimere, bivalente single-chain Fv Fragmente (sog. Diabodies) erzeugt. Diese sind ebenso potente MET Agonsiten wie die intakten Antikörper. Die Struktur eines Diabodies im Komplex mit zwei MET Molekülen könnte klären, ob die Anordnung der beiden Ektodomänen in einem signalaktiven MET Dimer relevant ist. Zum Vergleich steht die Struktur des 2:2 Komplexes mit L. monocytogenes InlB zur Verfügung. Zukünftig werden hoffentlich Strukturen von MET Komplexen mit HGF und dessen Splice Variante NK1 dazu kommen.In unpublizierten Vorarbeiten haben wir einen Schafs Diabody in Lösung mit Licht- und Röntgenkleinwinkelstreuung charakterisiert. Erste Kristalle des Diabodies und eines isolierten Schafs Fab Fragments liegen vor. Die Komplexbildung der künstlichen Liganden mit MET haben wir mittels Gelfiltration untersucht und so aus einem großen Satz die besten Kandidaten für die Co-Kristallisation identifiziert.Strukturen der künstlichen Liganden und ihrer Komplexe mit MET werden auch für eine denkbare Weiterentwicklung zu therapeutischen Zwecken in der Tumortherapie oder regenerativen Medizin von Vorteil sein.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen