Structural and functional characterization of the MET receptor with surrogate ligands
Biochemistry
Final Report Abstract
Der Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) Rezeptor MET, eine Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK), kontrolliert Überleben, Proliferation und Motilität von Zellen in Entwicklungsprozessen und bei der Geweberegenration. Für Wachstum und Metastasierung vieler Tumoren ist der HGF-MET Signalweg entscheidend. Auch das fakultativ intrazelluläre humanpathogene Bakterium Listeria monocytogenes aktiviert MET mit Hilfe des Invasionsproteins InlB und löst dadurch die Aufnahme in Wirtszellen aus. MET Aktivierung basiert wahrscheinlich auf Liganden-induzierter Dimerisierung des Rezeptors. Trotz seiner medizinischen Bedeutung ist die Struktur des signalaktiven, durch HGF stabilisierten MET Dimers bisher nicht bekannt. Zwei Kristallstrukturen von InlB gebunden an MET hatten unterschiedlich angeordnete 2:2 Komplexe gezeigt, von denen einer wahrscheinlich die signalaktive Struktur repräsentiert. In diesem Projekt verwendeten wir MET-bindende designed ankyrin repeat proteins (DARPins), um eine neue Kristallstruktur der MET Ektodomäne im Komplex mit dem bakteriellen MET Agonisten InlB und dem DARPin A3A zu erhalten. Die Struktur gibt wichtige Hinweise auf den Mechanismus der InlB-vermittelten MET Aktivierung und auf die inhibitorische Funktion von A3A. In der neuen MET/InlB/A3A Struktur sind zwei MET und zwei InlB Moleküle genauso angeordnet wie in einer der beiden bereits bekannten Strukturen des MET/InlB Komplexes. Das wiederholte Auftreten derselben Anordnung in verschiedenen Kristallformen unterstützt unsere Hypothese, dass es sich bei dieser Struktur um den signalaktiven Komplex handelt. In der Mitte dieses Komplexes vermitteln zwei InlB Moleküle die Homodimerisierung über ihre konvexen Seiten. Jedes InlB bindet ein MET, so dass zwei MET Moleküle auf der Außenseite des Komplexes sitzen. Über einen kleinen Kontakt ihrer beiden Immunglobulin (Ig)-ähnlichen IPT2 Domänen tragen die beiden MET Moleküle evtl. zur Stabilisierung des 2:2 Komplexes bei. Unsere Struktur deutet auf vier mögliche Salzbrücken hin, die durch symmetrische Kontakte zweier Glutamate (E719 und E732) und zweier Lysine (K665 und K723) der beiden IPT2 Domänen gebildet werden. Ähnliche Kontakte zwischen membrannahen Ig-ähnlichen Domänen in den extrazellulären Bereichen der RTKs KIT und PDGFR sind wichtig für die Aktivierung dieser Rezeptoren. Ob die vier Salzbrücken des Kontakts der beiden IPT2 Domänen zur Homodimerisierung und Aktivierung von MET beitragen, muss durch zellbasierte Assays mit MET, in dem die beiden Glutamate und Lysine mutiert wurden, geklärt werden. Prof. Plückthuns Gruppe hatte bi-paratopische Fusionen aus zwei MET-bindenden DARPins erstellt, die die Aktivierung von MET und nachgeschalteten Signalwegen effektiv hemmen. Interessanterweise tragen alle Fusions-DAPRins, die einen inhibitorischen Effekt zeigten, den DARPin A3A als N-terminalen Fusionspartner. Unsere Struktur zeigt, dass die Bindungsstelle für A3A auf der MET Sema Domäne sich mit der Bindungsstelle für die β-Kette des physiologischen MET Liganden HGF überlappt. Diese Strukturdaten stimmen mit der Beobachtung überein, dass A3A und HGF um die Bindung an MET konkurrieren. Die Orientierung von A3A auf der MET Sema Domäne legt nahe, dass der hemmende Effekt zumindest einiger biparatopischer DAPRins auf der Verbrückung zweier MET Moleküle auf der Zelloberfläche beruht.
Publications
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(2019) Distinguishing Between Monomeric scFv and Diabody in Solution Using Light and Small Angle X-ray Scattering. Antibodies 8(4): 48
Lüdel F, Bufe S, Bleymüller WM, de Jonge H, Iamele L, Niemann HH, Hellweg T
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(2019) Inhibition of the MET Kinase Activity and Cell Growth in MET-Addicted Cancer Cells by Bi-Paratopic Linking. Journal of Molecular Biology 431(10): 2020-2039
Andres F, Iamele L, Meyer T, Stuber JC, Kast F, Gherardi E, Niemann HH, Plückthun A
