Identifizierung der strukturellen Basis des Heterochromatin vermittelten Gene Silencing mittels korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie

• Antragsteller: Mikhail Eltsov, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 289147632

Die kontrollierte Inaktivierung von großen Teilen des zellulären Genoms ist essentiell für die zelluläre Differenzierung. Der Inaktivierungsprozess beginnt mit epigenetischen Modifikationen auf Ebene der Nukleosomen, die nachfolgend eine DNA Reorganisation in einen kompakten Zustand (Heterochromatin) bewirken, der inkompatibel mit der Transkription ist. Heterochromatin beruht auf der Bindung von Chromodomänen Proteinen, wie z.B. dem Heterochromatin Protein 1 (HP1), an modifizierte Nukleosomen was zu deren Reorganisation in Strukturen höherer Ordnung führt. Obwohl dieser Prozess grundlegend zum Verständnis der globalen Genregulation ist, ist die Heterochromatin Organisation auf Strukturebene unzureichend verstanden. In vitro Studien haben bisher zwei Typen von möglichen Multi-Nukleosomen Anordnungen beschrieben, das einzelgängige Solenoid und die zweigängige Zigzag Helix. Jedoch ist die Anordnung des Chromatins höherer Ordnung innerhalb der Zelle nach wie vor unklar. Dies ist zum einen bedingt durch die Schwierigkeit Chromatin im nativen Zustand zu konservieren und zum anderen durch das Fehlen von Strukturaufklärungsmethoden mit ausreichender Auflösung zur Analyse zellulärer Proben in situ. Mein Ziel ist es, diese Probleme durch eine Kombination von Lebendzell-Lichtmikroskopie und Kryo-Elektronentomografie zu überwinden, wobei die letztere Technik eine Auflösungsrevolution durchlebt hat, die es nunmehr ermöglicht, makromolekulare Komplexe in Nanometer Auflösung in situ innerhalb der Zelle dreidimensional zu visualisieren. In meiner bisherigen Arbeit habe ich eine zweigängige Anordnung der 30 Nanometer Chromatinfasern von Heterochromatin in Vogelzellkernen beschrieben. Überraschenderweise habe ich nun in bisher noch unveröffentlichten Studien mit hoher Wahrscheinlichkeit dieselbe Chromatinorganisation in perizentrischem Heterochromatin (PCH) von Drosophila gefunden. Dieses Ergebnis läßt auf eine universelle Heterochromatin Organisation schließen, die für einen universellen gene silencing Mechanismus verantwortlich sein könnte. Jetzt zum erstmalig technisch durchführbar durch die massiv verbesserte Auflösung der Tomografie bei Verwendung von Direktelektronendetektoren und neuartige Bildverarbeitungsalgorithmen, plane ich den dreidimensionalen Weg einzelner DNA Fasern in situ zu bestimmen, um die strukturelle Grundlage der Nichtverfügbarkeit dieser Fasern für die Transkription aufzuklären. Nachfolgend werde ich, basierend auf der normalen Heterochromatinstruktur, die molekulare Grundlage der Faserbildung analysieren, wobei sowohl der Einfluss von HP1 Mutanten als auch die vollständige oder teilweise Depletion von HP1 mittels in vivo RNA Interferenz Systemen analysiert werden sollen. Das Projekt hat zum Ziel die physiologische Struktur von Heterochromatin unter nativen Bedingungen aufzuklären, wodurch die strukturelle Basis des epigenetischen Silencing sowie die Rolle von Heterochromatin Proteinen in dessen Etablierung aufgeklärt werden sollen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen