Proteinbiosynthese in Chloroplasten: Bestimmung des Translatoms und Analyse von Translationsregulationsmechanismen

• Antragsteller: Dr. Reimo Zoschke
• Fachliche Zuordnung: Pflanzenphysiologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 289761529

Die plastidäre Genexpression ist essentiell für die pflanzliche Ontogenese und wird hauptsächlich auf posttranskriptioneller und translationeller Ebene kontrolliert. Dennoch ist in Chloroplasten der Landpflanzen wenig über Regulationsmechanismen der Translation, Translationsfaktoren und deren Funktion oder etwa die Verknüpfung der Translation mit co-translationellen Prozessen, wie z.B. der Proteinlokalisation, bekannt. Ziel dieses Projektes ist es, ein detaillierteres Bild der chloroplastidären Translation zu gewinnen, deren Regulationsmechanismen zu erfassen und einige der daran beteiligten Faktoren zu identifizieren und zu charakterisieren. Durch die deep-sequencing-basierte Analyse von Fußabdrücken, die translatierende Ribosomen auf der mRNA hinterlassen, ermöglicht Ribosome Profiling die umfassende Untersuchung von Translatomen. Über diesen Ansatz wird sowohl die Position als auch die Abundanz der translatierenden Ribosomen auf der mRNA erfasst, so dass eine genomweite Analyse der Translationsaktivität ermöglicht wird. Eine von mir entwickelte Modifikation dieser Methode erlaubt die Analyse der Ribosomen-Fußabdrücke mit Hilfe von hochauflösenden Microarrays und damit eine ökonomisch und zeitlich effiziente Untersuchung der chloroplastidären Translation. Die Kombination beider Methoden wird eine umfassende Analyse der chloroplastidären Translation erheblich beschleunigen. Die array-basierte Methode wird für die anfängliche Untersuchung von Translationsdynamiken in verschiedenen Mutanten und Entwicklungsstufen von Pflanzen genutzt, um die Auswirkungen veränderter Photosynthese- und Genexpressionskapazitäten auf die Translation zu sondieren. Anschließend werden spezifische Defekte und Regulationsmechanismen der chloroplastidären Translation mit Hilfe der deep-sequencing-basierten Methode im Detail analysiert. Daneben erlaubt eine, kürzlich von mir etablierte, methodische Variation die Analyse der Verteilung der Translationsmaschinerie zwischen Stroma und Thylakoidmembranen. Darüber hinaus werden innovative ribonomics-Methoden für die Identifikation und funktionelle Charakterisierung von neuen plastidären Translationsfaktoren zur Anwendung kommen. Insgesamt soll dieses methodische Spektrum dazu genutzt werden, folgende Fragestellungen der chloroplastidären Translation in der Modellpflanze Tabak zu bearbeiten:(I) Wie ist das chloroplastidäre Translatom definiert (ORFs, Start und Stop Codons, Spleißstellen, Edierungsaktivität etc.)?(II) In welchem Ausmaß trägt die Regulation der Translation zur Dynamik des chloroplastidären Proteoms während der pflanzlichen Entwicklung bei?(III) Finden sich in der Regulation der chloroplastidären Translation in Landpflanzen ähnliche, assemblierungsabhängige feedback-Mechanismen wie sie aus der Grünalge Chlamydomonas bekannt sind?(IV) Welche cis-Elemente und trans-Faktoren kontrollieren die Translationsregulation?

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen