Entwicklung eines biotechnologischen Enzymkaskaden-Prozesses zur Produktion chiraler beta-Aminosäuren
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ziel des Projektes war die Entwicklung eines Enzymkaskadenprozesses zur Herstellung chiraler β3-Aminosäuren ausgehend von racemischen (aryl-) substituierten Dihydropyrimidinen (z.B. Phenyldihydrouracil, PheDU). Dafür wurden 13 Hydantoinasen/Dihydropyrimidinasen bzw. putative cyclische Amidasen untersucht. Für sieben dieser Enzyme wurde die Hydrolyse von PheDU zu N-Carbamoyl-β-Phenylalanin (NCβPhe) nachgewiesen. Drei Enzyme aus Aminobacter sp. DSM24754 und DSM 24755 wurden ausführlicher charakterisiert. Die höchste mit PheDU gemessene Aktivität lag bei 1128 mU/mg für die Dihydropyrimidinase aus Aminobacter sp. DSM24754 (pM24754.2), diese zeigte allerdings keine Stereoselektivität für das Substrat. Die Hydantoinase aus Geobacillus stearothermophilus (pBGwtHyd) dagegen ist (S)-selektiv für PheDU und zeigte sehr gute Aktivität mit diesem Substrat. Zusätzlich wurde für vier Dihydropyrimidinasen Aktivität mit para-Chlor-PheDU nachgewiesen. Im zweiten Projektteil wurde nach Enzymen zur stereoselektiven Decarbamolyierung von NCβPhe zu βPhe gesucht. Ein Screening von Wildtypstämmen ergab Hinweise auf diese Aktivität. Daraufhin wurden 12 Enzyme der Enzymklasse (EC) 3.5 untersucht. Kein Enzym war in der Lage NCβPhe zu hydrolysieren, aber fast alle konnte die Hydrolyse von N-Carbamoylβ-Alanin (NCβAla) katalysieren. Daher wurde das Projektziel angepasst und der Frage nachgegangen: Welche Faktoren in der Molekülstruktur einer NC-Aminosäure (NCAS) beeinflussen dessen Akzeptanz als Substrat? Substrate (u.a. N-Carbamoyl-β-Homo-Aminosäuren, NCβHAS) wurden synthetisiert und Analytikmethoden entwickelt. Es wurden Hinweise auf Aktivität von mehreren β-Ureidopropionasen (βUP) mit NCβHAS gefunden. Zudem wurden in silico Enzymmodelle erstellt und Ligangendockingstudien durchgeführt. Schließlich wurde die βUP aus Pseudomonas aeruginosa PAO1 erstmals ausführlich charakterisiert. Das Enzym setzte die natürlichen βUP-Substrate NCβAla und N-Carbamoyl-α-Aminoisobuttersäure (NCAib) um und ist L-spezifisch für N-Carbamoyl-α-Serin, zeigte jedoch keine Aktivität mit NCβHAS. Die Entwicklung einer Enzymkaskade konnte wegen des fehlenden decarbamoylierenden Enzyms nicht umfassend bearbeitet werden. Jedoch waren alle aktiven Enzyme mit ihrem MBP-Tag immobilisierbar, und für einige wurde ihre Wiederverwendbarkeit demonstriert. Insgesamt war das Projekt erfolgreich. Geeignete Dihydropyrimidinasen wurden gefunden und ausführlich charakterisiert wurden. Die detaillierte Untersuchung von decarbamoylierenden Enzymen führte zu wertvollen Daten für weitergehende Untersuchungen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Development of an enzyme cascade process for the production of chiral β-amino acids. VAAM
Lohmann & Engel
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Screening, purification and characterization of decarbamoylizing enzymes for the production of chiral βamino acids. 4th International Summer School - Biotransformations
Lohmann
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Characterization of dihydropyrimidinases for biocatalytic production of chiral β-amino acids within an enzyme cascade process. 9th International Congress on Biocatalysis
Lohmann & Engel
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Development of an enzyme cascade process for the production of chiral β-amino acids. VAAM
Lohmann& Engel
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Screening, purification and characterization of decarbamoylizing enzymes for the production of chiral β-amino acids. 9th International Congress on Biocatalysis
Lohmann & Engel
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Development of an enzyme cascade process for the production of chiral β-amino acids. DECHEMA - Frühjahrstagung der Biotechnologen
Lohmann& Engel
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Screening, characterization and biotechnological use of decarbamoylizing enzymes. VAAM
Lohmann & Engel
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Development of an enzyme cascade process for the production of chiral β-amino acids VAAM
Rudat & Engel
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Development of an enzyme cascade process for biocatalytic production of chiral beta amino acids. European Federation of Biotechnology
Engel
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Characterization of dihydropyrimidinases for the biocatalytic synthesis of chiral beta amino acid. VAAM
Marcaux & Engel
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Enzymatic synthesis of non-canonical amino acids by carbamoylases. VAAM
Schwab & Engel
