Untersuchung der zeitlichen Entwicklung der Biofilmmatrix mit Hilfe der Raman-Mikroskopie (RM) und der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM)
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im durchgeführten Forschungsvorhaben wurde die kombinierte Anwendung der Raman-Mikroskopie (RM) und der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) für Biofilm- Untersuchungen etabliert. Die CLSM liefert dreidimensionale Information über den Aufbau von Aggregaten aus Mikroorganismen und EPS. Einschränkungen in der Anwendbarkeit und Kombination von Färbeprotokollen haben zur Folge, dass nur ein bestimmter Anteil der EPS (Glycokonjukate, Proteine) gleichzeitig mit den Nukleinsäuren (Bakterien) nachgewiesen werden kann. RM liefert vollständige Fingerprint-Spektren der Biofilmmatrix und gibt damit Aufschluss über die chemische Zusammensetzung der Biofilmmatrix, ohne dabei bestimmte Stoffklassen von Makromolekülen (Proteine, Polysaccharide, Lipide, Nukleinsäuren, u.a.) auszuschließen. Die prinzipielle Eignung der RM für die Charakterisierung der Biofilmmatrix wurde anhand der Analyse von unterschiedlichen Referenzproben (Polysaccharide, Proteine, Mikroorganismen und verkapselte Bakterien) validiert. Dadurch wurden charakteristische Bereiche und sogenannte Marker-Banden für unterschiedliche Biofilm-Komponenten identifiziert. Die RM-Untersuchungen der heterotrophen Biofilme wiesen auf eine heterogene chemische Zusammensetzung der Biofilmmatrix hin. Es zeigte sich, dass Raman-Spektren von unterschiedlichen Strukturen charakteristische Banden von Proteinen, Polysacchariden, Nukleinsäuren und Carotenoiden beinhalten, und dass eine ähnliche Morphologie der Probe zu vergleichbaren Spektren führte. Um mehr Information über Struktur und Zusammensetzung der Biofilme zu gewinnen, wurden ähnliche Proben (indentisches/vergleichbares Alter, Nährstoff- und Strömungsbedingungen) mit Hilfe der RM und der CLSM untersucht. Bei den RM-Analysen wurde ein deutlicher Einfluss des Kultivierungsverlaufs sowie der Nährstoffbedingungen auf die chemische Zusammensetzung der Biofilmmatrix festgestellt. Diese RM-Ergebnisse wurden durch die CLSM-Analyse dieser Biofilme bestätigt. Desweiteren ermöglichte der Einsatz des Raman-Mappings die semiquantitative Abbildung der Verteilung unterschiedlicher Komponenten (chemisches Imaging) in der Biofilmmatrix und ergänzt damit strukturelle Erkenntnisse aus CLSM-mikroskopischen Untersuchungen mit ortsaufgelösten Informationen über die chemischen Charakteristika der Biofilmmatrix. Bei der Raman-Analyse der Initialphase der Biofilmbildung hat sich jedoch herausgestellt, dass die RM oft keine ausreichende Sensitivität aufweist, da der Raman-Effekt durch eine geringe Quantenausbeute (10^-6 – 10^-8) gekennzeichnet ist. An dieser Stelle ist die Oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS) in der Lage, die Empfindlichkeit der RM wesentlich zu verbessern. Im Rahmen dieses Projekt wurde zum ersten Mal das Potential der SERS für die markierungsfreie ortsaufgelöste chemische Analyse (in situ chemische Bildgebung) der Biofilmmatrices demonstriert. Die Kopplung von RM und SERS ermöglicht zudem, trotz geringer Biomasse-Konzentrationen (schon ab Frühphase der Biofilmbildung), umfassende Informationen über die chemische Zusammensetzung der Biofilme und deren Veränderungen über den Kultivierungsverlauf und nach Behandlung mit dem oxidierenden Desinfektionsmittel Wasserstoffperoxid.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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In situ surface-enhanced Raman scattering analysis of biofilm. Analytical Chemistry 2008, 80, 8538-8544
N. P. Ivleva, M. Wagner, H. Horn, R. Niessner, C. Haisch
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Combined use of confocal laser scanning microscopy (CLSM) and Raman microscopy (RM): Investigations on EPS - matrix. Water Research 2009, 43, 63-76
M. Wagner, N. P. Ivleva, C. Haisch, R. Niessner, H. Horn
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Towards a nondestructive chemical characterization of biofilm matrix by Raman microscopy Analytical and Bioanalytical Chemistry 2009, 393, 197-206
N. P. Ivleva, M. Wagner, H. Horn, R. Niessner, C. Haisch
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Label-free in situ SERS imaging of biofilms. Journal of Physical Chemistry B 2010, 114, 10184-10194
N. P. Ivleva, M. Wagner, A. Szkola, H. Horn, R. Niessner, C. Haisch
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Raman microscopy and surface-enhanced Raman scattering (SERS) for in situ analysis of biofilms. Journal of Biophotonics 2010, 3, 548-556
N. P. Ivleva, M. Wagner, H. Horn, R. Niessner, C. Haisch
