Aufbau und Funktion des DctA/DcuS Sensorkomplexes von E. coli

• Antragsteller: Professor Dr. Gottfried Unden
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 298847751

Zwei-Komponentensysteme, bestehend aus einer membranständigen Sensorkinase und einem cytoplasmatischen Responseregulator, werden von Bakterien zur Erkennung von Umweltfaktoren und Steuerung der Zellantwort genutzt. Viele membranständige Sensorkinasen benötigen für ihre Funktion kleine akzessorische Proteine oder eigenständige Proteine, z.B. Transporter. Der molekulare Mechanismus der Transporter als Co-Regulatoren ist nicht bekannt. Die Sensorkinase DcuS (C4-dicarboxylate uptake sensor) von E. coli benötigt so die C4-Dicarboxylat-Transporter DctA oder DcuB zur Funktion. In Abwesenheit der Transporter ist DcuS permanent, d.h. ohne den Effektor Fumarat, im aktiven Zustand; diese überführen DcuS in den Fumarat-sensitiven Zustand. Die Vorarbeiten zeigten, dass (a) DctA mit DcuS einen Komplex bildet (DctA/DcuS), (b) DctA durch eine cytoplasmatische Helix (H8b) mit DcuS interagiert, (c) die Reizerkennung des Komplexes nur über DcuS erfolgt, und (d) dass DctA keinen Flux-Sensor darstellt, da Transport-defekte Varianten von DctA funktionelle DctA/DcuS Sensorkomplexe bilden. Entsprechend dem resultierenden Modell überführt DctA den Sensor DcuS strukturell in eine sensorisch kompetente Form. Vorarbeiten zeigen, dass der transmembrane Signaltransfer durch DcuS auf einer Kolbenhubbewegung von Transmembranhelix 2 (TM2) beruht. TM2 befindet sich im aktivierten Zustand in der periplasmatischen, im nicht-aktivierten Zustand in der cytoplasmatischen Position. Methoden zur Differenzierung beider Positionen wurden entwickelt.Nachdem mit DcuS ein System etabliert wurde, das eine molekulare Untersuchung von Carrier-kontrollierten Sensorkinasen erlaubt, soll in der folgenden Antragsperiode der Aufbau des DctA/DcuS-Komplexes und der Einfluß von DctA auf die Funktion von DcuS molekular analysiert werden. Der DctA/DcuS-Komplex konnte bisher nicht isoliert werden. Der Aufbau des DctA/DcuS-Komplexes soll durch neue Verfahren der Masssenspektrometrie, gezielte Vernetzung von DctA mit DcuS und Identifizierung der interagierenden Peptide charakterisiert werden. Zur Untersuchung des Interaktionsmechanismus werden die Interaktionsbereiche von DcuS und DctA kartiert. Die Position von TM2 von DcuS, die den Funktionszustand der Sensorkinase wiedergibt, wird in Varianten von E. coli, die kein DctA, kein DcuB, oder regulationsdefekte Mutanten von DcuB enthalten, bestimmt. Dies wird zeigen, ob DctA (oder DcuB) wie im Arbeitsmodell vorhergesagt die Funktion von DcuS über die Kontrolle der Lokalisierung von TM2 steuert. Die Untersuchungen werden teilweise alternativ zu DctA mit dem Transporter DcuB durchgeführt, da einige Untersuchungen mit DcuB eindeutiger durchführbar sind und von DcuB gut definierte Regulationsmutanten vorliegen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen